152例乙型肝炎患者基因分型与耐药突变的研究

汤 雄，黄 洁，柯云霞

(江西省九江市第三人民医院，江西 九江 332000)

目前，乙型肝炎病毒在中国一直呈现高感染率状态，HBV的携带者约有1.3亿，占全球患病人数的十分之一，感染现象较为严重[1]。核苷酸类似物是目前乙型肝炎病毒治疗的主力军，但近年来发现由于核苷酸类似物的广泛、长期不规范的使用，我国各地乙型肝炎患者体内均出现不同程度对核苷酸类似物的耐药突变[1-2]。一旦发生耐药情况，会大大降低抗病毒药物对乙型肝炎病毒复制能力的抑制作用。从而因为错误用药，延误患者的病情错过最佳治疗时机[3]。因此，检测乙型肝炎病毒的基因型和耐药基因位点分析有助于HBV患者选择更合理的治疗方案，对患者病情的改善及预后都有非常重要的临床意义[4-5]。

在对乙型肝炎患者在核苷类似物治疗过程中DNA病毒载量下降并持续免疫应答，但治疗一段时间出现病毒学复发，本研究对患者此时的基因型及几种核苷酸类似物耐药情况进行分析，以探讨和改善当地的乙型肝炎基因变异和耐药的情况，降低耐药发生率，提高疗效实现个体化治疗，对治疗乙肝炎有着重要意义。

1 材料与方法

1.1一般资料：选取2017年9月～2019年2月我院传染门诊及住院的慢性乙型肝炎感染患者152例，纳入标准HBV-DNA阳性(拷贝数>1.0×103)，其中男92例，女60例，平均年龄为(42.16±13.33)岁，患者均来自于九江地区市、县，均符合2015年中华医学会全国CHB诊断标准。所有病例的其他肝炎病毒(甲、丙、丁、戊)均为阴性，同时排除其他疾病感染。152例患者中，单独拉米夫定用药占30.9%(47例)，单独恩替卡韦用药占13.8%(21例)，单独阿德福韦酯用药占21.7%(33例)、拉米夫定联合阿德福韦酯用药占33.6%(51 例)。

1.2主要试剂与仪器:主要试剂：QIAampMinElute Virus Spin Kit，(德国Qiagen公司，货号57704)；2×Phanta®Max Master Mix，(南京诺唯赞生物，货号：P515-02)；HBV核酸荧光检测试剂盒(中山大学达安基因试剂公司，批号：2018007)。主要仪器：BioRad S1000 PCR仪；Biorad PAC300电泳仪；BioRad GEL DOC XR+凝胶成像系统；ABI3730XL测序仪。

1.3检测方法

1.3.1HBV-DNA定量检测所有患者标本留取清晨空腹静脉血3 ml，2 h内分离血浆。采用美国ABI7300 荧光定量PCR扩增仪进行扩增、定量分析，使用HBV核酸荧光检测试剂盒，并严格按照说明书操作。

1.3.2HBV耐药基因突变检测及基因分型：从血清或血浆样本提取HBV DNA，通过PCR扩增HBV P区RT段序列，共检测21个耐药位点：rt80、rt84、rt85、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt207、rt213、rt214、rt215、rt229、rt233、rt236、rt237、rt238、rt250，耐药位点覆盖HBV对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等抗病毒药物发生耐药的主要位点，其次进行扩增电泳产物分析，观察琼脂糖凝胶中对照品是否符合(HBV DNA阴性对照无条带，HBV-DNA阳性对照有清晰条带，且条带大小为871 bp)及患者HBV-DNA是否有条带及条带大小(见图1)。然后使用ABI3730xl测序仪对扩增的PCR产物进行测序。突变分析：使用生物分析软件Sequencher5.4.6将测序序列与NCBI发布的参考序列进行比对，进而分析耐药位点氨基酸是否发生突变。型别分析：将序列提交NCBI Genotyping tool，进行在线分型；或者使用Sequencher 5.4.6结合NCBI Blast功能进行批量序列分析；对于少数重组型样本，使用SimPlot 3.5进行重组分析。

1.4统计学处理：采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1152例乙型肝炎耐药患者的基因位点突变分布情况：本地区的152例乙型肝炎耐药检测中，97例检测出变异株，总耐药率为63.8%，其中单独拉米夫定用药的变异株29例，以rt204I/V、rt180M为主要的耐药突变位点，突变率占单独拉米夫定用药全部突变位点的39.7%和29.7%，单独恩替卡韦用药的变异株14例，以rt204I/V、rt180M、rt202G/I为主要的耐药突变位点，突变率分别是27.1%、44.1%和12.3%。单独阿德福韦酯用药的变异株18例，rt204I/V、rt180M、rt236T位点突变率分别是35.9%、23.4%和23.4%，拉米夫定联合阿德福韦酯用药的变异株36例， rt204I/V、rt180M、rt181T/V、rt236T位点突变率分别为38.2%、33.1%、13.9 %和4.4%。

注：M为marker，P561-P581为患者血清扩增结果，POS为阳性对照，N1和N2为阴性对照图1 乙型肝炎患者HBV-DNA血清PCR分析电泳结果

2.2不同基因型的乙型肝炎DNA在某个位点突变率比较：HBV-DNA的B基因型rt204、rt180位点突变率与C基因型比较，差异无统计学意义(P>0.05)，C基因型的rt181V位点突变率高于B基因型，B基因型的rt236T位点突变率高于C基因型，差异有统计学意义(P<0.05)，其他基因型各位点突变率差异均无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 97例不同基因型在不同位点突变率情况分析[例(%)]

2.3HBV的B、C基因型与几种核苷酸类似物突变位点rt204V+rt180M的关系:在97例耐药患者中，耐药见于B、C型基因型，以B基因型为主，B+C混合型未见耐药基因突变型耐药，突变位点rt204V+rt180M的突变率在拉米夫定和恩替卡韦中最高，分别为57.4%、40.4%，其次是替比夫定和恩曲他滨34.0%。见表2。

表2 97例不同基因型与几种核苷酸类似物突变位点rt204V+rt180M的关系[例(%)]

3 讨论

DNA的闭合环状结构容易导致其发生不同程度的突变，HBV在复制过程中由于RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校准功能，HBV基因组的突变率较其他DNA病毒高出10倍。随着核苷酸类似物抗病毒药物在HBV治疗的广泛应用，耐药率逐渐增高，耐药不仅导致病情的发展恶化，加大医治难度，增加医疗成本[6]。近几年，通过对核苷类药物发生 HBV 耐药突变机制的逐步了解和HBV基因分型对HBV抗病毒的临床指导作用的认识，为临床医生及时调整治疗策略，降低乙型肝炎病毒耐药突变带来的危害，实现对慢性乙型肝炎患者个体化治疗具有重要的指导意义[7]。

本研究利用巣式PCR和Sanger测序法对九江地区152例慢性乙型肝炎患者进行HBV核苷类似物耐药突变及基因型检测。结果显示，九江地区的慢性乙型肝炎HBV基因型以B型、C型为主，B型占明显优势(70.8%)，C型感染者病情发展比较重，一般在重症肝炎、原发性肝癌病例中 C基因型较为多见，与很多南方地区报道[7-8]一致。在152例样本中检测到97例发生耐药变异，突变率为63.8%，其中以rt204V、rt180M的单点突变为主，两个位点突变率分别高达37.2%和37.9%。97例样本中单独拉米夫定用药和拉米夫定联合阿德福韦酯用药的变异株最多，拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦是目前临床上应用较广泛、安全有效的三种核苷类抗HBV病毒药物，前期临床试验表明，拉米夫定和阿德福韦酯可以快速有效地抑制HBV-DNA的复制合成及抑制病毒活性，但不足以清除HBV，所以慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗是一个漫长的过程，在长期的抗病毒治疗中容易产生病毒变异[9-10]。本研究中，拉米夫定耐药相关位点除了rt204V、rt180M外，还检测有rt217R、rt80I、rt207L等位点，恩替卡韦耐药相关突变还有rt202G/I、rt184G 及 rt173L等位点。由于九江地区医药匮乏，很多患者只能使用第一代核苷类似物进行抗病毒治疗，从而出现大量拉米夫定和阿德福韦酯变异株，因此产生多重耐药的患者应该谨慎合理用药，及时检测耐药突变位点，合理优化治疗方案，避免病情进一步加重。

综上所述，九江地区乙型肝炎HBV以B基因型为主，B+C混合型型未见耐药基因突变型，B基因型的rt204V、rt180M突变率最高，并以单独拉米夫定用药和拉米夫定联合阿德福韦酯用药这两种抗HBV方案产生耐药株为主，所以慢性乙型肝炎患者在进行药物治疗前必须选择好无耐药性的药物，在治疗过程中及时了解耐药突变体的流行情况，加强对乙型肝炎治疗效果评估，为制订本地的预防耐药提供理论参考。