烟草单倍体基因编辑系统的建立

蒋佳芮，许力，李锐，张建铎，向海英，高茜，宋春满，邓乐乐，杨文武，杨光宇，张承明，李雪梅，曾婉俐

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南省昆明市红锦路181号 650231；

2 云南省红河州烟草公司建水分公司，云南省红河哈尼族彝族自治州建水县临安镇钟灵路3号 654300

基因编辑技术不仅是解析阐明基因功能的重要工具，在植物育种上更为划时代的重大突破。新兴的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重组的效率，实现基因组的精确、定向改造，包括归巢核酸酶、锌指核酸酶和TALEN 核酸酶都已在植物基因工程中得到广泛、成功的应用，而基于CRISPR/Cas 系统的基因组编辑技术则更具有高效方便等特点[1]。CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，串联间隔短回文重复序列）是近几年来新发现的一种基因定点编辑技术，CRISPR/Cas9 是目前应用最多的，只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA: tracrRNA（CRISPR-derived RNA: trans-activating RNA）复合体就可对特定外源DNA序列进行剪切，该技术已在拟南芥、烟草、水稻等多种植物中成功编辑，证明了该技术的可行性，并实现了植物抗逆境、延缓果实成熟、增加杀草剂耐受性、抗病等效果[2]。

在烟草中类胡萝卜素是最重要的萜烯类化合物之一，不仅直接影响烟叶的外观质量，而且还直接和间接地影响烟叶的内在品质，其相关降解产物与烟叶的香气质和香气量也有密切的相关性[3]。八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）是类胡萝卜素合成过程中的关键酶之一[4]。无色的八氢番茄红素转化成有色类胡萝卜素的过程中，PDS 发挥重要的催化作用，该酶表达受到抑制，导致八氢番茄红素的积累，从而影响植物的花、叶、果中类胡萝卜素的合成，因此不同植物中PDS 的酶活性差异导致不同物种中类胡萝卜素含量的差别[5-7]。已有大量的研究表明，PDS 基因与白化相关[8-10]。

单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体，即凡由本物种正常个体的配子发育而来的个体，无论其体细胞中含有几个染色体组均叫单倍体，比如，普通小麦为六倍体，体细胞含六个染色体组，其花粉培育出的单倍体植株的体细胞中就含三个染色体组[11]。1922 年Guha 首次在曼陀罗（Datura stramonium L.）中发现天然单倍体[12]，1964 年Guha和Maheshwari 对曼陀罗花粉进行培养首次在离体条件下获得单倍体植株[13]。体外获取单倍体主要是通过对植物配子体细胞(雄配子体和雌配子体)进行离体培养，诱导其从配子体发育途径转向孢子体发育途径，进而形成单倍体胚胎。花药培养是常见的获得父本单倍体的方法，随着单倍体技术的不断发展和改进，单倍体已成为重要的遗传材料和研究对象。单倍体材料作为转化受体有以下3 点优势：（1）单倍体材料不会受到同源染色体联会配对的影响，转化效率可能会较高，外源基因在后代基因组中的稳定性也会较好；（2）导入的外源基因不会受到等位基因之间的相互干扰；（3）经转化后获得的植株不存在显隐性问题，加倍后即可获得纯合转化植株[14]。对单倍体基因组进行加倍，可在一个世代内获得遗传上100%纯合的双单倍体品系，从而大大加快植物品种选育进程。最近，已有研究在玉米、小麦中联合单倍体育种与基因编辑两种技术，可以在两代内产生具有所需性状改良的纯合DH（Doubled haploid，双单倍体）系，从而可绕开常规育种中复杂的杂交和回交的冗长程序[15-16]。本研究旨在为烟草基因编辑育种和基因功能研究提供了一种技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试材料

普通烟草（Nicotiana tabacum）品种红花大金元花药，采自石林印象烟庄大田种植的红花大金元烟株。

1.1.2 菌株与载体

LBA4404 根癌农杆菌电转化感受态细胞（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells，TaKaRa）。

质粒骨架，pORE-Cas9 骨架载体，携带卡那霉素抗性，获赠于西南大学夏庆友教授。

1.1.3 抗生素、激素和培养基

卡那霉素（100 mg/mL）、羧苄霉素（250 mg/mL）、NAA 母液（0.5 mg/mL）、6-BA 母液（1 mg/mL）、MS 培养基。

1.2 单倍体烟草材料的PDS 基因编辑方法

1.2.1 花药单倍体培育

烟草花药的预处理：采摘盛花期、无病植株上花冠与花萼等长的花蕾[17]，装入牛皮纸袋中放冰盒保鲜。在实验室将花药等分为8 份，1 份为新鲜花药作对照，其他7 份放置于4℃冰箱分别预处理1～7 d。

烟草花药离体培养：花蕾用75%酒精对其进行表面消毒，然后用无菌水清洗3～4 次。剥离萼片和花冠，将花药接种到活性炭培养基上培养，培养条件：温度为25±1℃，光照强度30～50 μmol/(m2·s)，光照时间为16 h/d，培养45 d。花粉粒分化形成愈伤组织后长出幼苗，用剪刀或者手术刀进行分离，然后将其置于含有活性炭MS 培养基的培养瓶中，以上述相同条件下培养30 d 进行壮苗培养。

烟草幼苗倍性鉴定：利用叶片气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定单倍体。根据大量关于烟草单倍体鉴定的研究结果显示[18-21]，取第5 片真叶观察下表皮气孔保卫细胞中叶绿体数，叶绿体数分界临界指标为叶绿体数少于14～15 的为单倍体，多于14～15 而少于24～26 的为红花大金元对照植株（异源四倍体，后文统称为四倍体），鉴定准确率可达98.5%。

1.2.2 PDS 质粒载体构建

PDS sgRNA 序 列：GCTGCATGGAAAGATGAT GATGG[22]。

将靶序列上下游引物（上游引物：GATTGGCT GCATGGAAAGATGATGA；下游引物：AAACTCAT CATCTTTCCATGCAGCC）双链退火并与预先用BsaI 酶切过的pORE-Cas9 骨架载体连接。连接体系：酶切载体100 ng，退火产物2 μL，T4 连接酶1 μL，T4 Buffer 1 μL，ddH2O 补 齐 至10 μL，16 ℃连接30 min。取连接产物转化Trans5α 感受态细胞，37 ℃培 养12～16 h。 用U26-JCF：5'-TTAGGTTT ACCCGCCAATA-3'和靶序列下游引物对菌斑进行阳性克隆的PCR 扩增、克隆和测序筛选。从测序正确的菌中提取纯化质粒，-20℃冰箱保存备用。

构建的PDS 基因编辑质粒载体如图1 所示。

图1 PDS 基因编辑质粒图谱Fig. 1 PDS plasmid profile of gene editing system.

1.2.3 单倍体基因编辑的遗传转化

农杆菌菌液制备：按照购买的LBA4404 农杆菌电转化感受态细胞提供的说明步骤，将带有编辑PDS 基因片段的质粒电转化LBA4404 农杆菌，进行相应的培养，最后利用MS 液体培养基悬浮菌体至OD 600 = 0.6～0.8。

烟草叶盘遗传转化：将确定为单倍体的植株，利用手术刀对叶片进行切取，获得约1×1 cm2的叶盘。同时，切取同叶龄的红花大金元四倍体无菌苗叶盘作为对照。将单倍体和对照的叶盘分别浸入到上述悬浮菌液中10 min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，置于MS 共培养基上进行共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3 d。3 d 后将叶盘转至MS 分化培养基上进行分化培养，直至形成分化芽，每7～10 d 更换一次分化培养培养基，更换5～6 次，培养条件为：28℃光照培养16 h/d，光照强度30～50 μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8 h/d，45～60 d。待愈伤组织上分化芽培养长至2～4 cm 高，切下分化芽，插入MS 生根培养基上进行生根培养，在上述相同培养条件下培养7～10 d 至生根。在生根培养阶段，观察统计分化苗白化情况并记录。

1.2.4 转化幼苗编辑靶点分子检测

随机选择单倍体和四倍体转化植株中表型为白化的植株各10 株，取叶片检测编辑靶点，测序公司为诺禾致源生物技术公司。

2 结果

2.1 单倍体培育结果

2.1.1 单倍体幼苗培育

每个实验组及对照组各100 粒花药，大量的花药在培养过程中褐化，少量花药膨胀形成愈伤组织。45 d 培养后，形成愈伤组织率及获得单倍体植株数量如表1 所示。其中，在低温处理4～6 d 后，花药形成愈伤组织率较新鲜花药培养有显著提高，并且从每粒花药所形成的愈伤组织中发出的单倍体幼苗数量也较多。大部分愈伤只能发出1～5 个幼芽，但少部分可丛生幼芽，能分离出20～40 株幼苗，这种现象在4℃处理4～6 d 的实验组中发生较多。图2 A-C 所示为花药到单倍体幼苗的培育过程；图2 C-D 为单倍体和四倍体的幼苗和叶片对比，单倍体的叶片较四倍体的叶片狭长。

2.1.2 单倍体鉴定

取第5 片真叶观察下表皮气孔保卫细胞中叶绿体数，叶绿体数分界以15 和26 为临界指标，叶绿体数少于15 的为单倍体，多于15 而少于26 的为四倍体。碘液染色后鉴别结果如图2 E-F 所示，分别为单倍体和四倍体第5 片真叶下表皮保卫细胞。单倍体（图2 E）绝大部分气孔保卫细胞中叶绿体数在7～13，四倍体（图2 F）的叶绿体数绝大部分在14～23。并且可以看出，单倍体气孔保卫细胞形状近圆，较四倍体小。

表1 低温处理花药形成愈伤组织及单倍体出苗数量Tab. 1 The number of callus and haploid by low-temperature treatment of anthers

图2 单倍体培育过程及下表皮保卫细胞叶绿体数鉴定倍性Fig. 2 The process of haploid culture and the chloroplast number of guard cells in lower epidermis for ploidy identification

2.2 单倍体PDS 基因编辑遗传转化结果

转化单倍体叶盘268 枚，红花大金元四倍体对照叶盘167 枚。遗传转化及组织培养后，获得单倍体T0代植株120 株，其中86 株为白化植株，占T0代植株的71.67%；红花大金元四倍体T0代植株51 株，其中24 株白化植株（5 株为嵌合体，即叶片部分白色，占白化植株20.83%），占T0代植株的47.06%。获得的T0代植株中，单倍体出现白化苗的概率（71.67%）较红花大金元出现白化苗的概率（47.06%）高。

表2 单倍体PDS 基因编辑遗传转化结果Tab. 2 The results of genetic transformation of haploid PDS gene editing

2.3 转化幼苗编辑靶点分子检测结果

烟草为异源四倍体植物，在其单倍体细胞中存在两套染色体组，故基因编辑过程中可能只有一条染色体上的基因位点被编辑，也可能两条染色体上的基因位点均被编辑。在T0代白化植株（不包括嵌合体）中，随机选取单倍体和红花大金元各10 株进行sgRNA 分子检测。10 株单倍体T0代白化植株中，2 个植株为编辑位点杂合（即峰图为编辑位点及之后双峰），8 个植株为编辑位点纯合（即峰图为编辑位点及之后单峰），存在插入和缺失突变，如图3 C 所示；10 株红花大金元T0 代白化植株中，6 个植株为编辑位点杂合，4 个植株为编辑位点纯合，存在缺失突变，如图4 C 所示。

3 讨论

图3 单倍体转化植株及分子检测结果Fig. 3 The transformation of plant and molecular detection results of haploid

图4 红花大金元转化植株及分子检测结果Fig. 4 The transformation of plant and molecular detection results of Honghuadajinyuan

在本研究中，烟草单倍体受体材料的高效获得，是进行单倍体基因编辑的基础。在花药培养过程中，大部分花药褐化干瘪，部分膨大但不形成愈伤组织也不出芽，王茂良等[23]的研究中提出过小孢子的发育去向。有研究指出，预处理有助于细胞脱分化，可提高小孢子的离体培养反应能力，烟草花药的预处理措施主要是通过低温诱导（一般0～9℃）[24]。国外有研究表明[25]，低温预处理不仅能延缓烟草花粉的退化，还能减轻花药药室壁组织的衰老，使更多花粉细胞开始新一轮的繁殖增长，提高花粉的抗逆境性。陈春艳等[26]研究表明，烟草花药在接种前的最适低温预处理时间为48 h，可明显提高胚状体的萌发诱导率。故本研究在4℃预处理不同天数，结果显示预处理4～6天花药出苗率更高。但同一批培养的花药，会出现有的花药可以出苗几十株，有的1～5 株，大部分不出苗的情况，这与陈学军等[17]的实验结果相似，这可能与实验操作、花药供体植株的生理状况、花药选取时间及花药的生理状况等有关。

在烟草育种工作中，育种目标是获得具有目的性状的纯合体。单倍体的染色体数是正常体细胞染色体数的1/2，理论上在单倍体中基因位点被编辑成功的概率更高，且编辑成功的单倍体加倍后获得的双单倍体即为纯合体，但烟草是异源四倍体，含四套染色体组，单倍体也含两套染色体组，故在T0代中仍会出现杂合情况，需要进一步筛选单倍体T0代中的位点纯合编辑体。本研究利用PDS 基因在编辑后产生白化植株作为编辑成功的可视化标志，故在T0代白化植株中随机选择各10 株进行编辑靶点分子检测，结果显示10 株单倍体白化植株中8 株为编辑位点纯合，10株红花大金元（四倍体）白化植株中4 株为编辑位点纯合，可见单倍体白化植株中编辑位点纯合的概率较四倍体更高。并且在经过遗传转化和组织培养后，获得的T0代植株中，单倍体出现白化苗的概率（71.67%）也较红花大金元出现白化苗的概率（47.06%）高。作为对照组的红花大金元T0代白化植株中出现嵌合体，而在单倍体实验组中没有出现嵌合体。在T0代白化植株中，位点纯合和杂合编辑体在表型上并无明显差异，还需辅助分子检测等手段筛选纯合编辑植株。在T0代绿色植株中，可能存在编辑但无性状的情况（可能只编辑了一条染色体），需要分子检测或者自交后确认，但本实验旨在T0代即可筛选出编辑成功的位点纯合编辑单倍体，故对该部分实验材料未进行进一步检测。这显示了单倍体作为受体材料的优势，单倍体细胞内基因发生的任何变化都可以通过染色体加倍一次性纯合[27]。传统育种获得纯合稳定品系需要连续7 代自交和选择，且无法实现所有性状的绝对纯合，而双单倍体技术只需1～2 代即可获得遗传上100%纯合的品系[28]。以单倍体作为基因编辑受体材料，如再利用单倍体加倍技术，可使后代迅速纯合并稳定遗传。

4 结论

本研究旨在为烟草基因编辑和基因功能研究提供了一种技术方法。（1）在花药单倍体培育方法中，低温处理适宜时间后，能有效提高花药形成愈伤组织及形成单倍体幼苗的效率。（2）本研究结果显示，单倍体作为基因编辑的受体，只含正常体细胞1/2 的染色体数，转化后植株位点纯合编辑概率更高。可结合利用加倍技术，快速获得基因编辑纯合体材料。