基于网络药理学探讨甘松干预心律失常的作用机制△

邓雅文，陈恒文，武庆娟，李军

中国中医科学院 广安门医院 心血管科，北京 100053

心律失常(cardiac arrhythmia)是心血管疾病中重要的一组疾病，多因心脏活动的起源和(或)传导障碍导致心脏搏动的频率和(或)节律异常而诱发，主要表现为心悸、气短、头晕乏力等症状，还可引起冠状动脉、脑动脉和肾动脉供血不足[1]。据统计，全球发生心源性猝死的人数超过700万，约占总死亡人数的25%[2]。在我国，心律失常的患者已超过2千万[3]，严重影响了患者的生活质量。目前心律失常的西医治疗仍以药物治疗为主，体外电复律和电除颤及射频消融术等非药物疗法的不断发展给患者带来更多治疗选择，同时也带来了药物不良反应和术后并发症等诸多问题；而传统的中医药注重“整体观”和“辨证施治”，具有不良反应较小，患者依从性相对较高等特点，对心律失常的患者的疗效越来越受到重视，特别是以甘松为主的抗心律失常的中药及其复方(参松养心胶囊和稳心颗粒等)在临床上广泛使用，取得了较为满意的临床效果。

甘松为败酱科植物甘松和匙叶甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根茎及根，主产于我国四川、云南和西藏等地。其味辛、甘，性温，归脾、胃经；具有理气止痛、开郁醒脾、外用祛湿消肿等作用。现代药理研究表明,甘松有抗癫痫、抗惊厥、抗抑郁、抗疟、抑菌、抗炎、抗心律失常、抗氧化、抗焦虑、改善血糖代谢等作用[4]。甘松主要成分包括萜类、黄酮类及酚类等[5]。一般认为当归素(angelicin)、甘松新酮(nardosinone)、甘松香酮A(kanshone A)和甘松香酮B(kanshone B)、甘松新酮二醇等为其主要有效活性成分[6-8]。

网络药理学是基于系统生物学学科基础，结合现有的药理学基础，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的一门新学科[9-10]。网络药理学不仅能揭示更复杂的药理学规律，更是从整体的角度对药物与疾病间的奥秘进行了探索。从系统性、整体性的方法学特点来说，网络药理学与中医药“整体观念”“辨证论治”的哲学思想不谋而合。本研究借助网络药理学方法，预测并筛选甘松干预心律失常的重要成分及其作用靶点，探讨甘松对心律失常可能的干预机制。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

BATMAN-TCM数据库[11](http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、ETCM数据库[12](http：//www.nrc. ac.cn：9090/ETCM/)、TCMSP数据库[13](http：//tcmspw.com/)收集甘松化学成分；TTD数据库(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)收集心律失常疾病相关靶点；重要成分对应靶点用BATMAN-TCM数据库进行预测；Venny在线网络获得成分交集及靶点交集；STRING version 11.0数据库构建作用靶点与相关蛋白质互作网络分析；FunRich version 3.13软件进行甘松基因靶点富集网络数据分析；靶点通路富集注释网络用KEGG在线平台分析并绘制。利用Cytoscape version 3.7.2软件构建成分靶点可视化网络。

1.2 甘松的化学成分收集及重要成分筛选

通过BATMAN-TCM数据库、ETCM数据库和TCMSP数据库，基于不同的计算机算法对中药“甘松”进行检索，收集甘松化学成分，将结果进行汇总。将筛选得到3个数据库共有的甘松化学成分作为其重要化学成分。

1.3 甘松化学成分靶点筛选

借助BATMAN-TCM数据库，基于产物相似、靶点相近、交叉验证的工作原理对甘松重要成分的靶点进行预测。

1.4 心律失常疾病相关靶点及甘松治疗心律失常疾病作用靶点筛选

在TTD数据库、GeneCads数据库中通过检索关键词“cardiac arrhythmia”获得心律失常疾病相关靶点；靶点名称均选择UniprotKB提供的基因简称；将甘松重要成分所对应的预测靶点与心律失常疾病相关靶点进行映射，借助在线韦恩图直观读取并分析得到甘松治疗心律失常的作用靶点。

1.5 甘松治疗心律失常的重要成分-预测靶点可视化网络构建

将甘松重要化学成分名称与其对应的预测靶点通过Microsoft Excel表格进行数据编排，分别导入基于JAVA 8.0环境工作变量的Cytoscape version 3.7.2计算机可视化软件中，构建甘松重要成分-预测靶点网络。

1.6 蛋白互作(PPI)网络构建

将基于公共数据库及网站获取的甘松治疗心律失常的作用靶点上传到STRING蛋白质数据库“Multiple proteins”的功能框，选择人种为“Home sapiens”后获取PPI网络。如因靶点太少没有产生相关连接蛋白，可通过一次或几次的扩展获取关联蛋白。

1.7 GO富集注释分析及KEGG通路分析

运用FunRich version 3.1.3软件工具[14]，对关键靶点进行GO富集注释。该软件可以加载Gene Ontology数据库，建立甘松的关键靶点datasets后，选择Gene Ontology Functional Term 3组内容(生物学过程、细胞组分或分子功能)任一组，从中选择合适的图表。将甘松治疗心律失常的人源关键靶点导入KEGG数据库进行可能的靶点通路富集情况检索，并绘制甘松治疗心律失常的作用机制通路图。

2 结果

2.1 甘松化学成分

采用BATMAN-TCM数据库检索“GAN SONG”，靶点参数设置为“Score cutoff=20”，获得63个化合物，其中24个无结构信息，故予以排除，得到39个甘松化学成分。经ETCM数据库检索“甘松”，获得38个成分。通过TCMSP数据库中搜索“甘松”获得57个化学成分。除去重复成分，共得到108个甘松化学成分，见图1。

图1 不同数据库获取甘松化学成分的韦恩图

2.2 甘松重要成分及对应靶点

从TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM数据库中得到9个共有成分，作为甘松的重要成分，见表1。采用BATMAN-TCM数据库对9个重要成分所对应的靶点进行了预测，设置参数P-value为0.05(默认值)，经去重后得到预测靶点198个，见表1。

表1 甘松重要成分信息

续表1

2.3 心律失常疾病相关靶点及甘松作用靶点

以“cardiac arrhythmia”为关键词分别在Genecards和TTD数据库检索心律失常相关疾病靶点。获得GeneCards数据库中心律失常疾病相关靶点13个，TTD数据库中心律失常疾病相关靶点8个，除去重复疾病相关靶点，心律失常疾病相关靶点共19个。将甘松预测靶点与心律失常疾病靶点进行映射，取交集，得到甘松治疗心律失常作用靶点4个，分别为ADORA1、KCNQ1、KL、CAT，见图2。

图2 甘松预测靶点与疾病靶点共有作用靶点韦恩图

2.4 甘松治疗心律失常重要成分-预测靶点可视化网络

在Cytoscape version 3.7.2软件中导入甘松重要成分和预测靶点数据表，生成甘松治疗心律失常的重要成分-预测靶点可视化网络，见图3。根据疾病靶点-共同靶点-预测靶点数据信息，构建相关靶点网络，见图4。

2.5 PPI网络分析

上传甘松的4个作用靶点到STRING在线蛋白质数据库(http：//string-db.org/)中，发现作用靶点较少，无法生成相关蛋白质之间连接，需要扩展靶点。通过2次扩展后，得到除4个作用靶点之外的10个关联靶蛋白，分别是GSR、SOD1、SOD2、SOD3、GNAI2、KCNE3、KCNE2、KCNE1、AKAP9、FGF23。因此，共14个靶蛋白作为关键靶蛋白，见图5。

2.6 GO富集分析

通过PPI分析扩展得到的14个关键靶蛋白，加载到FunRich软件中Gene Ontology数据库进行GO Term富集分析。其中，生物学过程条目(biological process)160条，分子功能(molecular function)条目26条，细胞组分(cellular component)条目26条。在生物学过程方面中，根据P<0.001选择显著性富集条目有：心室肌细胞膜复极的调节(regulation of ventricular cardiac muscle cell membrane repolarization)、膜复极参与动作电位的调节(membrane repolarization during ventricular cardiac muscle cell action potential)、心肌收缩的调节(regulation of cardiac muscle contraction)、心室心肌细胞动作电位的膜复极(GO：0098915)、钾离子跨膜外输(GO：0097623)等，见图6。

在分子功能方面中，根据P<0.001筛选最显著富集的条目有5条，包括电压门控钾通道活性与心室肌细胞动作电位复极化(GO：1902282)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity)、延迟整流钾通道活性(delayed rectifier potassium channel activity)、钾通道调节活动(potassium channel regulator activity)和离子通道结合(ion channel binding)，见图7。在细胞组分方面，以P<0.001筛选显著性条目只有电压门控钾通道复合体(voltage-gated potassium channel complex)条目，见图8。

注：菱形代表重要成分；三角形代表对应的预测靶点；红色菱形代表含有对应靶点的重要成分；淡绿色菱形代表没有对应靶点的重要成分；深灰色三角形代表预测靶点。图3 甘松重要成分与预测靶点的可视化网络

注：浅蓝色圆形代表靶点；数字1所连接的区域代表疾病靶点；数字2连接的区域代表共同靶点；数字3连接的区域代表预测的靶点。图4 疾病靶点-共同作用靶点-预测靶点网络

注：节点代表靶蛋白；边代表功能相关性；蓝色线条代表共存证据；紫色线条代表有实验证据；黄色线条代表文本挖掘；黑色线条代表共表达的数据。图5 甘松治疗心律失常作用PPI网络

图7 甘松治疗心律失常的分子功能富集分析

图8 甘松治疗心律失常的细胞组分富集分析

2.7 甘松治疗心律失常的关键靶蛋白KEGG通路分析

依据靶点富集在通路的个数和错误发现率(false discovery rate，FDR)确定甘松治疗心律失常可能的KEGG通路有17条，主要涉及过氧化酶(peroxisome)、长寿相关通路(longevity regulating pathway)、心肌细胞肾素能信号(adrenergic signaling in cardiomyocytes)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、cGMP-PKG信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)等(见表2)。选择其中过氧化酶、心肌细胞肾素能信号通路进行绘制，见图9～10。

表2 甘松治疗心律失常的关键靶点KEGG分析(17条)

续表2

注：白色节点代表信号通路蛋白；红色代表甘松的关键靶点蛋白。图9 甘松治疗心律失常的主要通路——过氧化酶

注：白色节点代表通路蛋白；红色代表甘松的关键作用靶蛋白；实线箭头代表直接关系；虚线箭头代表间接关系。图10 甘松治疗心律失常的主要通路——心肌细胞肾素能信号通路

3 讨论

甘松始载于唐代《本草拾遗》，从1963年正式收入《中华人民共和国药典》，具有芳香开窍、行气解郁的功效。据《本草纲目》记载，甘松“甘，温，无毒，主治恶气、卒心腹痛满、下气”，说明甘松能解久病之郁滞，能入心经，具有安心、养血和定悸的功效。甘松药性温而不燥，味甘，具有开郁醒脾、理气止痛之功，还能调节脾胃升降之机，具有补而不滞的功效。现代药理研究显示，甘松具有抗焦虑、抗心律失常、抗抑郁、抗氧化、改善心肌缺血、调节血压、改善血糖代谢及减少消化性溃疡面积等诸多功效。临床应用中，甘松常被用于治疗心血管疾病和消化系统疾病。市场上常见的稳心颗粒、参松养心胶囊，其中的主要组分就包含甘松。目前从甘松中分离提取的化合物按化学结构可大致分为萜类、黄酮类、香豆素和木脂素类、挥发油、糖类、无机元素及其他类[14]，其中以萜类化合物含量较高，具有较好的药用价值。根据《中华人民共和国药典》2015年版[4]对甘松的记载，甘松新酮是甘松干燥品的最具代表性成分。甘松化学成分复杂，目前其抗心律失常的作用机制尚不清楚。因此，通过网络药理学技术初步研究甘松抗心律失常的作用机制具有重要意义。

本研究采用网络药理学方法检索甘松的化学成分，并对核心交集成分进行靶点预测，将作用靶点经蛋白互作扩展后得到的关键靶蛋白进行GO分析和KEGG通路分析，并对甘松抗心律失常的靶点机制进行网络构建与分析。本研究检索得到甘松的9个重要成分，对重要成分的对应靶点进行预测，去除成分中相同的靶点后得到198个预测靶点。将预测靶点映射心律失常疾病靶点，得到甘松抗心律失常的作用靶点是ADORA1、KCNQ1、KL和CAT。对甘松抗心律失常作用靶点进行PPI分析，通过扩展靶点共得到14个关键靶点蛋白，并进行GO-Term富集分析。甘松抗心律失常作用在生物学过程方面，与心室肌细胞膜复极的调节、心室肌细胞动作电位中的膜复极、延迟整流钾通道活性、钾离子跨膜外输显著相关；分子功能方面与电压门控钾通道活性与心室肌细胞动作电位复极的关系、超氧化物歧化酶活性、延迟整流钾通道活性、钾通道调节活性功能显著相关；细胞组分方面与电压门控钾通道复合体显著相关。通过KEGG分析得到甘松预测靶点的17条通路，涉及了过氧化酶、长寿通路、心肌细胞的肾上腺素信号通路、调节脂肪细胞的脂解作用信号通路、胃酸分泌、Foxo信号通路、cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路等。

基因表型及基因突变在遗传性心律失常疾病中具有十分重要的意义。已知研究显示，ADORA1又名腺苷A1受体，是G-蛋白偶联受体。A1受体激活抑制腺苷环化酶，降低细胞内cAMP的浓度，诱导钾离子通道的开放，从而间接降低钙离子进入细胞的渗透能力。腺苷能减慢窦性心律，尤其是房室传导，有减慢心率的作用(A1作用)，可用于治疗室上性心动过速。其作用是诱导钾离子通道的开放，允许钾离子流出，从而增加细胞极化，并能降低缺血再灌注后造成的心肌损伤。由KCNQ1蛋白组成的通道主要存在于内耳和心肌中。在心脏组织中，这些通道在每次心跳后都参与心肌充电，使其保持有规律的节奏。KCNQ1基因突变与长QT综合征关系密切，有研究[15]发现KCNQ1基因突变易导致轻度I通道功能障碍，携带KCNQ1基因突变的患者发生严重心律失常和猝死的风险较一般正常人高。基于此，甘松的靶点预测对相关新药开发有一定的参考价值。目前仅有文献报道甘松抗心律失常可能与环磷酸腺苷(cAMP)有关，但其他通路还待进一步发现和实验确证。cAMP是一种环状核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，使cAMP底物蛋白磷酸化，从而加速对钙的摄取和转运。该信号通路作为重要的细胞内转导通路，是通过腺苷酸环化酶活性的变化来调节靶细胞内第二信使cAMP的水平，进而影响细胞代谢行为等下游事件[16-17]。简鹏等[18]通过对大鼠腹腔内注射甘松主要活性成分甘松新酮，选用激光共聚焦显微镜测量心肌细胞钙离子变化，用凝胶成像法检测cAMP及PKA的变化，发现甘松新酮能明显抑制心肌细胞钙离子超载，促进心功能恢复，预测甘松新酮可能是通过影响cAMP-PKA细胞信号转导通路来起作用的。

综上，本研究预测的靶点与已知文献报道的甘松治疗心律失常的作用基本吻合，体现了靶点预测的准确性，同时揭示了甘松多成分、多靶点、多途径作用的特点。目前有关甘松作用靶点、抗心律失常机制层面的研究报道较少，还需后续更多实验的验证。通过网络药理学分析可为今后深入研究甘松干预心律失常的分子机制提供一定的参考。