中医“芳香辟秽”理论指导下芳香精油在农业生态种植中的应用潜力△

董鲜，李晴晴，霍莹莹，陈传娇，曾子盈，2，段素素，2，马玉楠，程永现，2*

1.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；2.深圳大学 医学部药学院，广东 深圳 518060

植物与动物不同，动物当面临不利环境时可以直接逃走，也正因此，植物进化出独特的防御策略，以应对不良环境对其造成的威胁。对于植物来说，为了弥补其的不动性，能与生物环境相互作用，形成了不同的防御机制[1]，包括主动和被动防御机制[2]。植物为保护自己免受食草动物和病原体的侵害，能产生大量的次生化学物质，其中一些化学物质一直被用于病虫害防治[3]。植物形成的“抗生素”得到最多关注的是植保素[4]。

植物病害严重威胁着农业的良性发展。在现代农业生产中，为保证栽培作物的产量，大量化学杀菌剂的施用已成一种常规[5]。虽然短期内能提高经济效益，但由此引发的更为严重的问题不可忽视，如：土壤污染、农药残留、致病菌抗性增强、新的突变菌株产生、有益微生物被毒杀、微生态失衡等。尽管公众普遍关注合成农药对健康和环境的长期影响，但由于天然生物农药生产成本高、开发周期长等瓶颈问题，其尚未在市场上占据较大份额。植物源杀菌剂的毒性和残留量都很低，对环境、动物和人类大多是友好的。植物源农药由植物在胁迫环境中不断进化所产生的化学物质组成，可用于防御病原微生物[6]。其中，挥发性有机化合物的释放自1980年以来一直受到关注[7]。植物挥发油是植物次生代谢中有气味、易挥发的产物，广泛应用于传统医药、食品调味保鲜剂、香料工业和农业[8]。挥发油从天然植物和香料中提取出来，以其良好的抗菌和抗氧化性能而闻名，也因其挥发性而不会产生任何残留效应而引起关注[9]。本研究就挥发油的植物资源、抗菌活性、活性成分、可能的抗微生物机制及其在农业领域中的应用作一综述。

1 植物资源

大多数挥发油广泛存在于各种芳香植物中。到目前为止，已经确认了近3000种挥发油，其中300种具有重要商业价值，特别是在制药、农艺、食品、卫生、化妆品和香水行业[10]。我国约有56科136属300种芳香植物，主要分布于温带至中温带，特别分布于菊科、柳科、乌梅科、唇形科、姜科、樟科、木兰科、马兜铃科、马鞭科、禾本科、缬草科等科中[11]。挥发油可以由所有植物器官，即芽、花、叶、茎、枝、种子、果实、根、木材或树皮合成，并储存在分泌细胞、表皮细胞或腺毛等植物组织中。挥发油含量在植物中一般小于1%，少数在10%以上。其含量随植物种类、植物器官或生长阶段的不同而变化。由于分析方法和设备的限制，多数研究对植物挥发油的化学成分只进行了鉴定。随着毛细管气相色谱的应用和完善，可以识别出数十种甚至数百种化学物质，这将有利于香料资源的深入开发和寻找，也有利于优良芳香植物品种的选育。从植物中提取挥发油的方法有多种，目前主要采用沸水或水蒸汽蒸馏法、冷压萃取法、液体二氧化碳法或微波法[10]。采用水蒸气蒸馏法和超临界流体萃取法，挥发油的提取率和纯度均高于其他方法。

2 挥发油抗菌活性及其主要活性成分

挥发油的抗菌价值在于其所具有的生物活性成分及其对病原菌的特殊作用机制。对各种挥发油的化学成分初步定性研究表明，其存在醇、醛、酮和酚类等化合物[11]，含量可能因季节或存在部位而异[12]。这些挥发性化合物被认为是“绿色农药”概念的一部分，是有利于环境保护的天然抗菌物质[13]。据报道，挥发油的抑菌活性成分一般由1，8-桉叶酚、香茅醛、香茅醇、乙酸香茅酯、柠檬烯、芳樟醇、β-蒎烯、γ-松油烯、α-松油醇和芳香烃等组分组成。芳香植物中的主要生物活性成分被认为是次生代谢物的组合[14]。多种挥发油都具有抗氧化、抗真菌、抗毒素等活性，可用于抑制农产品变质所涉及的病原菌，并可作为合成化学品的生态替代物，用于治疗多种细菌和真菌病害。此外，挥发油也被认为是一种有效的消除玉米烯酮(1种镰刀菌毒素)污染和/或解毒的手段[13]。

笔者就具有农用抑菌活性的挥发油且研究较为集中的8个科(姜科、樟科、伞形科、菊科、唇形科、芸香科、禾本科和马鞭草科)以及对病原菌有较强抑菌活性的主要活性成分进行分类总结。

萜烯类是精油的主要成分。萜烯类化合物来源于许多异戊二烯单元(C5H8)，其连接在一个链中，该链可能是环状的，也可能不是环状的[15]。根据分子中异戊二烯基的数量，萜烯可分为单萜烯类、倍半萜烯或二萜衍生物。单萜烯类由2个异戊二烯单元组成，如柠檬烯、没药烯、α-蒎烯和β-蒎烯，它们主要存在于柑橘、姜花、锡兰肉桂、香樟、月桂、芫荽中(见表1)。倍半萜烯由3个异戊二烯单元组成。β-石竹烯是1种天然的双环倍半萜，是许多精油的主要成分，特别是在丁香、肉桂、黄花蒿、胜红蓟、百里香的精油中(见表1)。本团队前期研究以及已发表文献表明，佛手挥发油、D-柠檬烯和γ-松油烯对三七的3种病原菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌和毁坏柱孢霉)均有效，最低抑菌浓度(MIC)为0.12～12.05 mg·mL-1[16]。其中，D-柠檬烯和γ-松油烯抗菌活性均强于完整精油。黄花蒿挥发油的主成分β-石竹烯，崁烯对尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌抗菌活性强于完整精油[17]。

萜类化合物是一大类天然存在的化合物，在精油中是从异戊二烯单位衍生出来的。但与萜烯不同，萜类化合物中的异戊二烯单元是以许多方式组装和修饰的，例如添加或除去甲基或在异戊二烯单元中加入氧原子[18]。类似地，萜类化合物可以根据异戊二烯单位的数量分为单萜类、倍半萜类或二萜类，也可以根据其所包含的循环结构的数量进行分类。萜类化合物是一大类抗菌成分，对微生物具有广谱活性。常见的抗菌萜类化合物有1，8-丁烯醚、芳樟醇、樟脑、乙酸香叶酯、香叶醇、神经醇、萜烯-4-醇和肉桂醛(见表1)。萜类化合物比萜烯类化合物具有更高的抗菌活性，如黄花蒿精油及其萜类成分对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌抑菌活性均高于佛手挥发油中的萜烯类化合物[16-17]。大多数萜类化合物的抗菌活性与其官能团有关[19]。

酚类化合物是指一类由羟基直接与芳香环结合而成的化合物。酚类包括百里香酚、丁香酚和香芹酚，可在百里香、丁香、肉桂和牛至油中找到 (见表1)。许多研究报道，含有高含量酚类物质的精油具有广泛的抗菌功效[20]，如丁香酚对25种不同细菌的抗菌活性结果表明，只有1株细菌活性未被抑制[19]。本团队研究表明，丁香挥发油主成分丁香酚对导致三七根腐病的5种病原真菌(尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉、腐霉病菌、立枯丝核菌)和2种导致地上部病害的病原真菌(炭疽病菌、灰霉病菌)具有广谱抑菌活性[21]。其他研究表明，沙丁氏百里香精油的抗菌性能主要与其高含量的香芹酚和百里香酚有关[22]。同样，2种化学型冬凌草精油对6株革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌生长的抑菌活性的研究表明，以香芹酚为主的挥发油(75%)的抗菌活性最高，而另一种主要成分为4-萜烯醇(25%)的化学型活性较弱[23]。苯酚的抗菌活性与其羟基有关，苯环的存在增强了酚类化合物的抗菌活性。例如，对伞花烃(p-cymene)有1个不具有羟基的苯环，单独使用并不是一种有效的抗菌成分[24-25]，抑菌活性差异可能是由于缺乏1个自由的羟基来交换质子，从而抑制了其改变细菌细胞膜完整性的能力。此外，羟基在酚醛环上的相对位置也会影响抗菌效果。如香芹酚比百里香酚和丁香酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌具有更强的抑菌作用[26]。

不同精油的组合或精油的化学成分组合可以产生4种可能的抗菌效果：协同作用、加和作用、无关作用或拮抗作用[27]。因此，有研究对精油组合的有效性进行评估，以提高其抗菌效果，降低农业中农药的使用水平。混合精油的协同或拮抗作用取决于所测试的精油类型和微生物菌株。笔者前期研究结果表明，将佛手挥发油与化学农药恶霉灵进行复配，发现恶霉灵与佛手挥发油具有较高的协同效应，分级抑菌浓度指数(FICi)较低 (FICi = 0.31～2.00)[16]。当公丁香挥发油与恶霉灵联合使用时，对腐霉、灰霉病菌和炭疽菌有协同作用。母丁香挥发油与恶霉灵的组合对镰刀菌、腐霉菌和灰霉病菌均表现出加和效应[21]。因此，目前很难预测精油混合物的抗菌效果。精油是由多种化合物组成的复杂混合物，各成分之间的相互作用可能会产生协同或拮抗的抗菌作用。总的来说，多项研究得出的结论是，将精油主成分按比例混合时，精油的抗菌活性大于所使用主要成分[28-29]，这表明精油中的次要成分由于具有协同作用，可能对抗菌活性至关重要。

表1中列出了常用的具有抗菌性能的精油的主要成分，大多数具有高抗菌效果的成分是酚类，其次是含氧萜类化合物。精油中的萜烯和其他成分，包括酮和酯类，如香叶烯醋酸牻牛儿酯显示出较酚类和萜类化合物偏弱的抗菌活性。

表1 不同科属来源代表性植物抑菌活性

续表1

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3 挥发油可能的抑菌机制

精油的抑菌机制主要取决于精油中化学成分的类型。不同的成分可能通过不同的机制运作，同时，由于不同种类的微生物细胞膜组成不同，如革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌，精油的作用机制也有差异，因为精油中不同的成分可能有不同的或多个靶点[67-68]。因此，很难预测使用精油后微生物的易感程度，以及不同菌株敏感程度不同的原因[69]。研究者将精油的抑菌机制归因于它们能够通过微生物细胞外膜和细胞质膜渗透到细胞内部，从而分解细胞结构[69]。此外，精油的某些化学成分特别是酚类，可以作为质子交换剂而具有独特的抑菌机制，降低细胞质膜的pH梯度，特别是当被其他成分促进时，由此导致的质子驱动力(PMF)的崩溃和三磷酸腺苷(ATP)的耗尽最终导致细胞死亡[68]。当微生物细胞接触不同的精油时，精油的抗菌活性可能涉及细胞外膜和细胞质内的不同作用。当微生物细胞只接触到低浓度或亚致死浓度的精油时，细胞膜仍能通过改变脂肪酸饱和程度、碳链长度、支链位置、顺式/反异构化以及不饱和脂肪酸(UFAs)在细胞膜中转化为环丙烷来保持其流动性[70-71]。一些研究人员研究了精油成分的分子结构对其抗菌活性的影响。萜烯类化合物的抗菌机制发生在细胞膜水平，其抗菌活性被归因于抑制呼吸和其他能量依赖过程的能力[72]。然而，萜烯类化合物作为单一成分的整体抗菌活性是无效[67]。

挥发油是一种非常复杂的天然混合物，由于多种成分共同起效，其似乎没有特定的细胞靶点[73]。目前，对挥发油机理的研究较少，所取得的成果有限。提出的机制主要有以下几个方面：1)影响细胞壁和细胞膜的正常功能。挥发油作为一种典型的亲脂性物质，可通过细胞壁和细胞质膜，破坏其不同层的多糖、脂肪酸和磷脂的结构，并使其渗透。细胞壁和细胞膜的损伤可导致细胞质膜、细胞质大分子的渗漏和裂解[74]。通过扫描和透射电镜观察到肿胀、皱缩、空泡、质膜和细胞质的渗漏[75]。2)改变能量代谢和还原酶系统。由于挥发油作用下细胞渗透性改变，线粒体和过氧化物酶体也会受到影响，可引起线粒体膜和DNA的损伤。挥发油通过降低膜电位和影响Ca2+循环，诱导线粒体膜去极化[76]。其他离子通道、质子泵和ATP库也受到影响。膜的流动性会发生变化，最终导致氧化应激和生物能量失效。然而，从挥发油衍生出的各种生物活性组分的大多数可能的作用模式都是间接证据，缺乏系统的基于验证的研究。由于挥发油是许多分子的复杂混合物，从这个意义上讲，为了生物学的目的，研究挥发油比研究其某些成分更能提供更多的信息，因为协同作用的概念似乎更有意义。因此，有必要进行深入、全面地实验室研究，以确定芳香植物的有效抗菌方式。

4 挥发油系列农药或肥料产品的开发所面临的机遇和挑战

“中医农业”就是将中医原理和方法应用于农业领域，实现现代农业与传统中医的跨界融合、优势互补、集成创新。有农用活性的植物资源虽然在早期就被筛选出来，但受到植物自然资源的限制、国民经济现状和使用者认知水平的影响，到目前为止，工业化生产中的植物农药品种仍然很少。植物挥发油来源于自然界，具有良好的环境相容性，是开发无公害农药的重要资源。目前，植物挥发油在农业抑菌中的应用十分有限，主要应用于医学领域。对这类植物而言，对挥发油的农业抑菌活性的研究将扩大挥发油资源在农业中的应用。前期笔者开展了大量挥发油的活体实验，例如，佛手挥发油在连作土壤中对三七进行了进一步的评价，发现与不加挥发油的三七相比，其发病率和病情严重程度都有所降低[10]。在公丁香精油喷洒在三七叶片试验中，公丁香精油与恶霉灵联用的防治效果达60.77%[21]。黄花蒿石油醚提取物(主要成分与挥发油组成相似)在很大程度上抑制了三七根腐病的发生[17]。生姜挥发油可以显著抑制三七根腐病害发生率且不影响三七植株的生物量积累[30]。

植物挥发油的化学成分复杂多样，但抑菌化合物可能只是其中的一种或多种。这些物质之间也可能存在复杂的拮抗或协同效应，这意味着挥发油中的活性化合物需要分离和鉴定，以便为开发新的农药提供必要的资源。精油的化学分子组成对其抗菌效果起着重要的作用。精油的抑菌活性涉及微生物细胞中的几个靶点，其中最重要的是细胞膜，细胞膜通常具有渗透性，从而导致细胞成分的泄漏。微乳、纳米乳液、脂质体和生物膜等给药系统已被用于提高精油的抗菌效果和利用。今后的研究需要侧重于：1)发现和确定更多的抗菌精油；2)评价不同精油的有效性以及与不同化学农药组合的协同效应；3)从分子水平上了解精油的抗菌机制，如蛋白质合成、核糖核酸(RNA)合成、脱氧核糖核酸(DNA)合成和中间代谢；4)开发有效的传递系统，将精油与其他化学农药或生物杀菌剂一起封装，以实现一种协同替代办法，最大限度地减少化学农药使用的负面影响，有助于改进、综合和可持续的病害管理。因此，挥发油具有广阔的市场发展前景，有可能成为发展绿色农业、降低农业生产成本和出口农业创汇的有力武器。