干细胞治疗心脏病的研究进展

邓海燕 刘馨 缪着 马波

心脏病包括心脏传导系统疾病、心肌缺血、心力衰竭和心律失常等，严重威胁国民经济与健康。在中国，心脏病的患病人数持续增加，2002 ～ 2016年急性心肌梗死（myocardial infarction，MI）的死亡率总体仍呈上升态势[1]。目前治疗心脏病的方法包括外科手术治疗、介入治疗和药物治疗等。其中药物治疗的效果有待增强，外科手术过程中产生的创面大，易引发多种并发症。相比之下，介入治疗为微创手术，但也伴随着不同程度并发症的发生，这些方法都无法对已经坏死的心肌产生治疗作用[2]。干细胞能自我更新，其在特定条件下能够产生至少一种终末分化细胞，有望修复或替换心肌病、心力衰竭和冠心病等心脏病发作时损害的心脏组织，能够改善患者心功能，提升生活质量[3]。尽管干细胞治疗机制复杂，但随着研究者们的不断探索，从临床前研究到临床试验，人们对干细胞治疗的认识越来越深入，本文针对干细胞在心脏病中的修复作用机制及研究进展进行综述。

一、干细胞治疗心脏病的机制

干细胞的治疗机制为分化作用和旁分泌作用。分化作用主要依赖于干细胞的分化功能，诱导心肌再生。心脏干细胞 （cardiac stem cells，CSCs）能分化为心肌细胞（cardiomyocytes，CMs）。多潜能干细胞包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）与诱导多能干细胞 （induced pluripotent stem cells，iPSCs），分化能力强，经过诱导能够分化为内皮细胞、心肌样细胞和其他可能恢复心肌功能的修复细胞等。新的CMs 能负担一定的舒缩功能，将干细胞分化形成的CMs 移植到心脏缺血病变部位，移植细胞与原CMs整合使心肌再肌化，从而恢复心脏结构并改善心脏功能。

有研究者提出移植干细胞的旁分泌机制在细胞移植后发挥着主要治疗作用。大量实验表明干细胞在移植后的缺血缺氧环境中存活率低，少量的细胞不足以发挥治疗作用，但移植细胞可以分泌多种细胞因子和外泌体等生物活性物质。基质细胞衍生因子-1 （stromal cell-derived factor-1，SDF-1）已被证明参与干细胞的动员、归巢、增殖和分化，在干细胞归巢到损伤心肌中具有重要作用；AKT 又称蛋白激酶B，缺氧和AKT 诱导干细胞因子是来源于间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）的旁分泌因子，是胰岛素样生长因子1 受体 （insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）的配体，激活MEK/ERK1/2 和IGF1R/AKT 通路，发挥心脏保护和心脏再生作用；JAK/STAT3 通路介导的信号转导与心肌肥大期间成纤维细胞中胶原蛋白表达上调相关[4-6]。外泌体内含多种物质，能参与细胞间信息交流，miR-24 （来源于心肌球源性细胞的外泌体）通过靶向弗林蛋白酶调节心脏纤维化，减少了心肌瘢痕的形成；氧化应激为心脏疾病发展过程中的关键步骤，心脏祖细胞 （cardiac progenitor cells，CPCs）来源的外泌体中miR-21 能下调程序性细胞死亡因子，保护CMs 免受氧化应激引起的细胞凋亡[7-8]。

干细胞研究中，移植前需要对细胞进行鉴定与纯化，移植后需要进行细胞定位，量化其数量，评估其生存能力，并确定它们是否可以整合到周围细胞中，对心功能是否有改善作用[9]。干细胞治疗的缺点是移植的活细胞保留率低，靶向性差，而且干细胞来源的CMs 移植后可能导致畸胎瘤的形成、心律失常和免疫排斥反应的发生。Khan 等[10]发现心肌内注射小鼠ESCs 来源的外泌体后未在MI 小鼠模型中观察到肿瘤的形成。Liu 等[11]研究发现用能够缓慢释放细胞外囊泡的补片进行试验不会增加MI 大鼠的心律失常负担，结果表明外泌体有望在MI 后心脏修复中发挥治疗作用的同时克服干细胞治疗的一些缺点。

二、不同类型干细胞在治疗心脏病上的应用比较

目前进入临床研究的干细胞包括CSCs、MSCs、ESCs 和造血干细胞等，主要针对扩张型心肌病 （dilated cardiomyopathy，DCM）、缺血性心肌病和心力衰竭等疾病。常见的干细胞移植途径有经导管冠状动脉内注射、心肌内注射和静脉注射等。干细胞技术与组织工程学的结合促进了细胞补片的发展，为干细胞提供了新的移植途径，生物材料支架的应用有助于细胞的生长，能改善缺血缺氧微环境带给细胞的不良影响，提高细胞存活率。

（一）ESCs

ESCs 由囊胚的内细胞团分离培养而来，具有多向分化潜能，能够分化为心脏谱系细胞，理论上可作为最佳的体外CMs 来源，但其具有伦理学争议和致瘤的风险，使用此类干细胞进行的临床研究相对较少。直接注射在心肌部位的移植细胞受局部微环境影响大，存活率低。在Menasché 等[12]进行的Ⅰ期临床实验中，将人ESCs 诱导分化为CPCs，然后嵌入纤维蛋白支架中形成细胞补片，在进行手术冠状动脉搭桥术的同时将细胞补片移植至患有严重心力衰竭患者的MI 区。3 个月后，患者症状改善，超声心动图显示先前应用细胞补片治疗的非血运重建区出现新的收缩，无心律失常、肿瘤形成和免疫抑制等不良反应。另一项临床研究证明了生产临床规模人ESCs 来源的心血管祖细胞技术的可行性和在MI 后严重左心室功能障碍患者移植后的短、中期安全性[13]。以上研究表明，人ESCs 在临床实验中能够取得良好的治疗效果。

ESCs 还能应用于抗肿瘤药阿霉素引起的心肌病，阿霉素可能通过激活不同的分子和病理生理机制诱导CMs 死亡。Silva Dos Santos 等[14]研究了来源于小鼠ESCs 的CMs对阿霉素诱导的小鼠心肌病模型的治疗作用。结果表明，心肌内移植ESCs-CMs 可恢复小鼠心功能，与安慰剂组相比，射血分数与每搏输出量增加。

（二）iPSCs

自2006年日本科学家将分化的小鼠体细胞在特定的诱导因子Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 过表达作用下得到iPSCs以来，iPSCs 成为了研究热点[15]。iPSCs 与ESCs 类似，能够分化为心脏谱系细胞，iPSCs 技术可以对患者成体细胞重编程，为自体来源细胞，可以降低免疫排斥反应。

由于多能干细胞来源的CMs 在结构和功能特性上与新生儿期的CMs 相似，表现出不成熟的基因表达谱、结构和功能，这可能限制其收缩活性，移植到成人心脏后导致心电不稳定性，易发生心律失常[16]。在Gao 等[17]研究中，使用来源于人心脏成纤维细胞的iPSCs，将其分化的心血管细胞群制备成人心肌补片在动态条件下培养，与收缩和钙瞬变相关的基因表达增加，表现出显著的功能成熟，成人心肌补片移植可改善左室功能，减少瘢痕边缘区CMs 凋亡。DCM是一种以左心室或双心室的心室扩张和收缩功能障碍及充血性心力衰竭症状为特征的心肌疾病。Streckfuss-Bömeke等[18]分离培养了1例由RNA结合基序蛋白20 （RNA-binding motif protein 20，RBM20）中S635A 的错义突变引起的DCM 患者的皮肤成纤维细胞，将其重编程为特异性诱导多能干细胞 （RBM20-iPSCs），再分化为患者特异性的CMs（RBM20-iPSCs-CMs）。他们研究了RBM20-iPSCs-CMs 的功能和细胞生物学，表明RBM20-iPSC-CMs 和工程心肌是研究RBM20 依赖性DCM 的分子和病理生理机制的合适模型系统，这可能有助于未来开发患者特异性治疗策略。

iPSCs 技术还在不断发展中，重编程的成功率低，iPSCs具有基因组不稳定性，有致癌风险。但其与ESCs 相比，患者自身来源的iPSCs 发生免疫排斥反应的可能性降低，且无伦理学争议。目前应用iPSCs 治疗心脏病的临床研究较少，比较多的是通过采集患者血样或皮肤活检等，进一步处理得到iPSCs。iPSCs 保留了患者的基因组成，能产生“患者特异性”CMs，可用于研究心脏病的分子机制、药物筛选和疾病模型的建立等研究过程中。

（三）CSCs

研究证明心脏中留存少量心脏干/祖细胞，早期研究认为CSCs 是通过在心肌内分化为CMs 发挥作用的。随着2018年因学术不端引起的撤稿事件的发生，使CSCs 的治疗作用遭到了质疑，注射c-kit+心脏干细胞并未获得再生的CMs。然而，CSCs 的使用并非完全没有作用，可能通过其他机制来发挥治疗作用。研究表明冠脉内单次移植的CPCs能持续存在并继续增殖形成CMs，但这些细胞未能获得成熟的CMs 表型，而且数量比较少 （细胞核的4% ～ 8%），不足以解释直接分化带来的治疗作用[19]。并且，CPCs 单次移植引起了内源性CPCs、内皮细胞和表达α-横纹肌肌节肌动蛋白小细胞的形成，表明这有可能是依赖于旁分泌的治疗作用。

左心发育不全综合征是一种先天性心脏病，治疗方法一般为心脏移植或进行姑息性手术。有研究者进行了非随机对照Ⅰ期临床实验，左心发育不全综合征儿童患者在进行心脏手术时提取心房组织体外培养心肌球源性细胞，手术4 ～5 周后接受冠状动脉内心肌球源性细胞输注[20]。随访18 个月的结果显示，治疗组右心室射血分数增加，三尖瓣环径、右心室容积和室壁质量减少，无明显不良反应。他们的Ⅱ期临床试验对象除了左心发育不全综合征患者还包括功能性单心室患者，进行了随机对照疗效评估。结果表明，接受心肌球源性细胞移植患者的心室射血分数增加，心室容积减小，舒张末期容积指数降低，此外，还发现心肌球源性细胞治疗对心室功能较差的患者可能会产生更好的治疗效果[21]。

使用CSCs 的实验效果较好，但不足是CSCs 的获取需要进行创伤性的心脏活检，且细胞数量稀少，扩增手段有限，注射前需要较长时间的细胞培养才能达到注射需求量。

（四）MSCs

MSCs 是临床研究中使用最多的一类干细胞，它存在于身体的多个组织器官。MSCs 免疫原性低，低表达MHC-Ⅰ类分子，并缺乏MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40、CD40L、CD80 （B7-1）和CD86 （B7-2），使自体和异体MSCs制剂可以应用于临床试验，促进MI 后心脏重塑[22]。目前认为MSCs 对心脏的治疗作用主要依赖于旁分泌机制，其在组织损伤修复中发挥作用的机制可能与其分泌的多种生物活性因子有关，包括趋化因子、细胞因子、生长因子和激素等。旁分泌效应在抗炎和免疫调节、血管生成以及对抗心肌凋亡等方面发挥重要作用。

干细胞的质量与供体质量相关，自体MSCs 移植安全性高，但有些患者干细胞质量差，不宜进行自体干细胞移植术。MSCs 的免疫学特性使异体MSCs 移植术得以在临床应用，研究证明了经心内膜注射自体或异体MSCs 治疗DCM 的安全性。异体MSCs 产生了一系列比自体MSCs 更具临床意义的效应，包括射血分数、6 min 步行距离和MLHFQ 评分的改善，此外，DCM 引起的内皮功能损伤仅在异体干细胞的治疗中得到改善[23-24]。异体MSCs 与自体MSCs 治疗效果的差异可能与SDF-1α 有关，高水平的SDF-1α 会损害MSCs 治疗作用的有效性，异体MSCs 分泌的SDF-1α 水平低于自体MSCs，使DCM 患者血浆的肿瘤坏死因子水平降低，同时促进了内皮祖细胞的生物活性。

MSCs 分泌的可溶性因子PGE-2、IDO、IL-10 和TGF-β等生物活性物质能够调节免疫细胞的活性，抑制炎症因子的产生。众多观点表明急性MI/缺血性心肌病和非缺血性心肌病中心脏功能逐渐恶化部分是过度持续的炎症反应导致的，MSCs 发挥全身抗炎作用改善心脏功能。一项临床前研究表明静脉注射MSCs 能改善缺血性心肌病小鼠左心室功能，还伴有MSCs 诱导的免疫调节作用，抑制了自然杀伤细胞的作用，减少了中性粒细胞数目[25-27]。由于静脉输送干细胞的心脏靶向性差，现有的临床研究主要局限于通过冠状动脉内或心肌内注射等方法将细胞直接输送到心肌部位。Butler 等[28]进行了一项Ⅱ期临床随机试验，将骨髓间充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）经静脉注射到慢性非缺血性心肌病患者体内。结果显示，自然杀伤细胞减少程度与左室射血分数的改善程度相关，静脉输注同种异体缺血耐受BMSCs 的治疗作用与循环炎症细胞数量改变相关。表明静脉输注BMSCs 确实发挥了全身作用，能调节炎症反应，这种全身效应可能是通过抗炎特性介导的非心血管系统效应。

MSCs 外泌体还能刺激新生血管的生成，Teng 等[29]使用人脐静脉内皮细胞进行血管生成实验，将其与外泌体孵育12 h 使管样结构形成。结果表明，MSC 来源的外泌体可以被内皮细胞内化，可增强人脐静脉内皮细胞的成管能力，在去除外泌体的条件培养基和磷酸缓冲液对照组之间，血管生成和心功能改善没有差异。

三、干细胞来源的外泌体在治疗心脏病的应用

外泌体是细胞衍生的从质膜释放到细胞外的微小囊泡，存在于许多体液中，在细胞间的信息交流中发挥关键作用。其介导的信号转导可能与蛋白质、细胞因子、脂质、mRNAs、rRNAs 和microRNAs 的转移有关，外泌体一旦分泌，可以进入体液、邻近的靶细胞或远处的细胞，靶细胞能通过多种方法 （如内吞、膜融合或配体受体结合）将外泌体内化[30]。外泌体富含生物活性物质，干细胞来源的外泌体可能代替干细胞发挥MI 后心脏修复的治疗作用，从而避免致癌风险和免疫排斥现象。外泌体是一种膜型载体，未经修饰的外泌体无靶向作用，可以通过构建特异性外泌体靶向缺血心肌。外泌体成分复杂，能够参与多种细胞过程，与细胞增殖分化、抗细胞凋亡和调节炎症反应有关。研究表明心肌球源性干细胞来源的外泌体将miR-181b 转移到巨噬细胞，降低蛋白激酶Cδ 转录水平，改变巨噬细胞表型，继而发挥保护作用[31]。

外泌体的组成取决于细胞类型，其在MSCs 的旁分泌机制中有重要作用。Wang 等[32]研究了BMSCs、脂肪MSCs和子宫内膜MSCs （endometrium mesenchymal stem cells，EnMSCs）在大鼠MI 模型中的旁分泌作用和治疗特性。结果显示EnMSCs 的旁分泌作用可加强心脏保护和血管生成作用，治疗作用更明显，可能与外泌体高表达miR-21 且在细胞间传递有关，miR-21 能介导调节PTEN/AKT 通路减少CMs 凋亡。除了细胞类型会对外泌体产生影响外，外泌体的分泌、含量和功能也会随细胞微环境的变化而变化。在缺氧缺血状态下，BMSCs 会产生一些具有抗凋亡作用的遗传物质或蛋白质，并以外泌体的形式存在于细胞外，最终达到抗凋亡的目的。研究者提取了缺氧预处理的BMSCs 来源的外泌体，经心肌内注射移植至急性MI 大鼠模型。结果显示缺氧预处理的BMSCs 来源的外泌体通过上调miRNA-24 的水平抑制了CMs 凋亡，说明进行预处理得到的外泌体具有治疗作用[33]。

外泌体分子结构小，是天然的内源性纳米载体，由于受到外脂双层的保护，蛋白质和RNA 可以在细胞外空间持续存在而不被降解。张海涛等[34]提取了健康成年人、急性ST段抬高型MI 患者和稳定型心绞痛患者外周血中的外泌体，运用基因芯片技术对外泌体的microRNA 进行测序。结果显示，三组外泌体中microRNA 的表达有明显差异，这些差异可作为冠心病诊断与治疗的靶点。外泌体治疗心脏病的研究尚处于起步阶段，在clinicaltrials.gov 官网上找到了目前正在进行的有关外泌体的临床研究，有心外膜脂肪外泌体在心房颤动患者中的作用，MI 患者外周血外泌体miRNA 表达谱及其与MI 的关系等。外泌体具有生物相容性和非免疫原性，稳定性高，因此，外泌体将成为有前景的治疗心脏病的方法。

四、干细胞移植治疗心脏病策略的改进

干细胞治疗心脏病无论是依赖分化作用还是旁分泌作用，高的细胞保留率对治疗效果十分重要，需要靶部位有效的细胞数量或者外泌体浓度才能发挥治疗作用。为了发挥局部心肌效应，目前大部分的给药方法为有创性的心肌内注射或者冠脉内注射。即使应用了这些方法，血流动力学的特点以及损伤心肌部位的缺氧和炎症的微环境使心肌内移植的活细胞水平较低。虽然外泌体可以通过静脉注射发挥旁分泌作用，但其通常聚集在肝脏中。通过对细胞或外泌体进行修饰可以增强其靶向性，基因修饰或者预处理可以增强干细胞的治疗作用[33,35-40]。干细胞移植策略的比较见表1。

心脏归巢肽 （cardiac homing peptide，CHP）能够优先结合到缺血心脏组织部位。研究者利用CHP 的这一特性，将CHP 与干细胞来源的外泌体结合形成CHP 外泌体，静脉注射到MI 动物模型中[36-37]。结果表明，CHP 外泌体能够使心肌部位的外泌体保留率增加，可以减少纤维化和瘢痕面积，增强细胞增殖和血管生成能力。对干细胞进行基因修饰可诱导具有治疗效应的细胞因子和相关蛋白质过表达以促进心肌损伤组织的再生过程，研究表明由AKT 基因修饰的人脐带MSCs 的外泌体通过促进血管生成对缺血心肌具有较好的修复效果。高迁移率组蛋白-1 预处理BMSCs 后可以提高BMSCs 旁分泌效应，减轻大鼠MI 程度，改善心功能[39，41]。对干细胞进行SDF-1、转化生长因子α 等细胞因子的前处理和缺氧缺血前处理，使干细胞拥有抵抗MI 部位炎性微环境的能力[42]。

五、总结与展望

对心脏病患者而言，干细胞移植可以改善心功能，促进血管新生和心肌再生。其临床前研究与临床试验已取得进展，干细胞的再生能力使干细胞在治疗心脏病上占据优势，干细胞治疗是非常有前景的治疗心脏病的方法。人体内多种类型干细胞可以应用于疾病治疗中，应用干细胞的伦理和免疫排斥等问题正一步步得到解决。但是目前的研究也暴露了一些问题，如干细胞移植后存活率不高，心脏功能恢复的效果不显著，研究结果不一致等。在关注干细胞治疗有效性的同时也要关注其稳定性和治疗的安全性，目前的研究多集中在干细胞的治疗效果上，干细胞的治疗机制仍不清晰，需要加强对机制的研究。

表1 干细胞移植策略的比较