二次谐波和偏振光影像技术在烧烫伤小鼠瘢痕胶原纤维病理变化中的应用

贺改英，唐靖惠，马淑骅，孙娅楠，杨伟峰，王 毅*

（1.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

烧烫伤引起的瘢痕发病率高［1］，在一项为期5年的多中心随访研究调查中发现，在平均烧伤面积为10%体表面积的患者中，有78.9%烧烫伤患者有瘢痕［2］。瘢痕不仅影响美观，伴随着瘙痒和疼痛［3］，而且瘢痕的挛缩常引起关节活动受阻，这些对患者的心理和生理均产生了重要影响［4-6］，所以早期防治和评估烧烫伤瘢痕至关重要。胶原纤维是细胞外基质的主要成份，占真皮的70%～85%，烧烫伤后胶原纤维的变化直接影响了瘢痕的愈后、皮肤弹性和拉伸强度等功能，所以活体动态评估瘢痕部位胶原纤维的病理改变，可为药物筛选和临床治疗提供指导。

目前评估创伤愈合瘢痕形成过程主要是通过肉眼观察拍照评估，它只能记录创口表面表征，有一定的主观性，容易造成试验结果的误判。研究皮肤深层的变化是主要通过取材后对瘢痕组织的胶原纤维进行病理染色，但这种方法不能定量检测胶原纤维的排列和密度等方面的信息。液晶偏光成像方法是近年来在皮肤创伤检测中新兴的试验技术，它通过对双折射特性明显的物质（如胶原纤维）进行定性和定量检测，反应皮肤深层结构信息，与病理染色方法相比有绝对的优势。

本试验通过二次谐波（second harmonic generation，SHG）成像技术活体、动态、无创检测瘢痕组织乳头层和网状层胶原纤维的排列规律和和密度变化，并与液晶偏光影像系统相对照，旨在通过总结规律，用光学成像技术建立一种活体快速、可定量的评估方法，为预防和治疗瘢痕形成的药物治疗提供检测方法，为瘢痕形成相关疾病的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

C57BL/6Cnc小鼠，12只，雄性，6～7周龄，体重（20±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2016-0006。将其饲养于12 h光照/12 h 黑暗的环境中，自由摄食和饮水。

1.1.2 主要仪器与试剂

4%多聚甲醛（中国，索莱宝公司）；异氟烷（中国，瑞沃德公司）；双光子扫描显微镜（日本，Olympus公司）；液晶偏光影像系统（美国，CRi Abrio公司）；石蜡切片机（美国，Thermo公司）；小动物麻醉机（中国，瑞沃德公司）；倒置显微镜（日本，Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立和试验分组

12只C57BL/6Cnc小鼠随机分为2组，即正常对照组（sham）和瘢痕组（scar）。C57BL/6小鼠被适应性饲养1周后，经麻醉后背部进行剃毛和脱毛处理。对文献［7］中动物烧烫伤模型的构建方法进行改良建立小鼠烧烫伤模型。scar组使用96.5℃的水蒸气在背部胸椎段中间部位造模6 s，建立创伤面为1 cm直径的深度烧烫伤模型，使用伤口敷料进行包扎。72 h后模仿临床烧烫伤处理方法去除结痂，常规饲养6个月。

1.2.2 SHG成像技术

各组小鼠麻醉后固定于双光子显微镜载物台上，采用激发波长为850 nm［8］，数值孔径为1.05的25倍水浸显微物镜对真皮组织进行z轴扫描，步进5μm，图像采集像素为 1 024 pixel×1 024 pixel，420～460 nm滤光片收光，采集速度4μm/pixel，观察正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围乳头层和网状层胶原纤维，通过Java图像处理与分析软件（image processing and analysis in Java，Image J）分析胶原纤维排列方向和胶原纤维面密度，其中胶原纤维面密度是胶原纤维所占面积占总面积的比值。

1.2.3 液晶偏光影像技术

各组小鼠取相应部位组织，将其置于4%多聚甲醛中固定48 h，经过修剪、脱水后，将组织进行包埋，切厚度为6μm的切片，进一步脱蜡，通过液晶偏光影像系统观察正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围乳头层和网状层的胶原纤维，并通过系统自带软件对胶原纤维方位角变异程度和相位差进行定量分析。

1.3 数据处理

一致性、密度、方位角及相位差数据均通过GraphPad Prism 6软件计算；所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析，以±s表示，P＜0.050为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 烧烫伤瘢痕和瘢痕周围外观的观察

常规饲养正常和烧烫伤小鼠6个月后，对正常皮肤和瘢痕部位进行拍照，观察小鼠正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围的外观（图1）。试验结果发现瘢痕部位皮肤颜色偏暗，与周围皮肤颜色不一致，而且瘢痕部位没有毛发生长。

图1 造模6个月后，小鼠正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围外观Fig.1 Appearance of normal skin, scar and scar edge after six months of burns

2.2 SHG成像技术研究烧烫伤瘢痕胶原纤维的病理变化

2.2.1 SHG成像技术研究烧烫伤瘢痕胶原纤维排列的变化

为了从皮肤水平面研究正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围水平面胶原纤维的排列，我们通过SHG成像技术检测乳头层和网状层胶原纤维，并通过Image J软件分析胶原纤维排列方向。正常皮肤乳头层胶原纤维纤细，网状层胶原纤维粗大，不管是乳头层还是网状层，其胶原纤维各个方向均有排列，呈随机排列的网状结构（图2a、2b）。 瘢痕部位乳头层和网状层胶原纤维排列方向一致，与表皮平行（图2a、2b），与正常皮肤比较，瘢痕部位乳头层和网状层胶原纤维排列一致性均明显增加（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周围胶原纤维排列与瘢痕部位相似，与表皮呈平行排列（图2a、2b）。如图2c所示，与正常皮肤比较，瘢痕周围乳头层和网状层胶原纤维排列一致性均显著增加（P＜0.010，P＜0.010）。这些结果表明，从水平面观察瘢痕和瘢痕周围乳头层和网状层的胶原纤维，其排列方式发生了改变，这种改变会影响皮肤正常弹性和拉伸性能的发挥。

2.2.2 SHG成像技术研究烧烫伤瘢痕胶原纤维面密度的变化

为了从皮肤水平面分析正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围皮肤水平面胶原纤维面密度的变化，本试验通过图像处理与分析软件Image J对乳头层和网状层SHG成像的胶原纤维面积进行分析。正常皮肤乳头层胶原纤维稍纤细，网状层胶原纤维粗大，但排列均稀疏（图3a），纤维面密度较低（图3b）。与正常皮肤比较，瘢痕部位乳头层和网状层胶原纤维面密度明显增加（图3a、3b）（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周围与正常皮肤比较，乳头层和网状层胶原纤维面密度分别增加了1.35倍和1.60倍（图3a、3b），具有统计学意义（P＜0.050，P＜0.001）。这些结果表明，不管是瘢痕部位还是瘢痕周围，乳头层和网状层水平面的胶原纤维均明显增生。

2.3 液晶偏光影像技术研究烧烫伤瘢痕胶原纤维的病理变化

2.3.1 液晶偏光影像技术研究烧烫伤瘢痕胶原纤维排列的变化

液晶偏光影像技术不仅可以对具有双折射特性的物质进行成像，对排列方向进行伪彩标注，将相同方向的双折射信号按照同一颜色进行标注，同时可对双折射物质的方向进行定量分析。胶原纤维具有双折光性，所以液晶偏光影像技术可以对胶原纤维进行伪彩标注成像和分析。

为观察正常皮肤、瘢痕和瘢痕周围皮肤矢状面胶原纤维的排列，我们通过液晶偏光影像技术对离体组织胶原纤维排列的方位角进行检测。胶原纤维呈现的双折射信号方位角的变异程度代表胶原纤维排列方向的特征，变异程度越小，说明胶原纤排列方向越一致，反之，说明呈随机排列。正常皮肤乳头层和网状层胶原纤维均呈现多种颜色，胶原纤维方位角变异程度大（图4a）。瘢痕部位乳头层和网状层胶原纤维颜色较少，呈平行排列，与正常皮肤比较，乳头层和网状层方位角变异程度均显著降低（图4a、4b）（P＜0.001，P＜0.010）。瘢痕周围方位角与正常皮肤比较，其变异程度均显著降低（图4a、4b）（P＜0.010，P＜0.010）。这些结果表明瘢痕和瘢痕周围乳头层和网状层矢状面胶原纤维的排列方向变异程度降低，方向趋向一致。

2.3.2 液晶偏光影像技术研究烧烫伤瘢痕皮肤胶原纤维密度的变化

通过液晶偏光影像技术对离体组织矢状面胶原纤维的相位差进行检测，相位差值代表纤维组织双折光信号的密度，相位差值越大代表胶原纤维密度越大，反之密度越小。正常皮肤乳头层和网状层排列稀疏，胶原纤维相位差值较小。瘢痕部位乳头层和网状层排列密集，胶原纤维相位差值增加，与正常皮肤比较，乳头层相位差值增加，但没有统计学意义（P＞0.050），网状层相位差值显著增加（P＜0.010）。与正常皮肤比较，瘢痕周围乳头层和网状层排列均密集，胶原纤维相位差值均增加（P＜0.050，P＜0.010），具体结果详见图5。以上结果表明，瘢痕部位和瘢痕周围乳头层和网状层矢状面的胶原纤维明显增生，这与人体烧烫伤瘢痕的特点一致。

图2 SHG成像技术检测乳头层和网状层胶原纤维排列的变化Fig.2 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

图3 SHG成像技术检测乳头层和网状层胶原纤维面密度的变化Fig.3 Area density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

图4 液晶偏光影像技术研究乳头层和网状层胶原纤维排列的变化Fig.4 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

图5 液晶偏光影像技术研究乳头层和网状层胶原纤维密度的变化Fig.5 Density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

3 讨论

瘢痕是各种创伤后所引起的正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变的统称［9］，创伤愈合后瘢痕的演变通常经历增生期、消退期和成熟期，不同时期瘢痕内的病理状态并非一致［10］。在啮齿类动物的烧烫伤瘢痕中，大量研究设置6个月作为研究瘢痕最长的时间［11-13］，这个时间可能是啮齿类动物瘢痕成熟期，所以本试验选择了6个月作为研究瘢痕的时间。

本试验在检测瘢痕部位胶原纤维病理变化的同时，还对瘢痕周围组织进行了检测，这是因为瘢痕周围可以反映烧烫伤部位愈合且不留有瘢痕皮肤的胶原纤维是否正常。瘢痕部位没有毛发生长，瘢痕周围部位有毛发，但不易脱毛，脱毛后残留毛根粗、长，而正常部位毛发容易脱毛，脱毛后残留毛根细、短。本试验的检测需要对病理组织进行脱毛处理，所以容易辨别瘢痕周围组织、瘢痕组织和正常组织。

在皮肤的真皮组织中，胶原纤维含量占70%～85%，是细胞外的主要成分。研究发现胶原纤维的排列和密度在皮肤的生物力学特性中发挥着重要作用［14］。正常皮肤胶原纤维呈网状结构，胶原纤维面密度较小，这种结构特点维持了皮肤正常的弹性和拉伸强度，而在瘢痕组织中，胶原纤维的排列［15-17］和密度［18-21］均发生了改变。为进一步观察真皮不同深度胶原纤维的病理变化，本试验从真皮的分层着手研究，真皮分为乳头层和网状层［22］，乳头层和网状层在结构和功能等方面表现不同。乳头层是紧邻表皮的薄层结缔组织，胶原纤维细密，乳头层含有丰富的毛细血管和游离神经末梢，其主要作用是加强与表皮的连接，为表皮提供营养。网状层是位于乳头层下方的厚层结缔组织，胶原纤维粗大，交织成网状结构，其主要作用是为皮肤提供结构支撑和拉伸作用。本试验从乳头层和网状层的角度，分别研究了烧烫伤小鼠瘢痕和瘢痕周围胶原纤维的排列和密度，结果发现乳头层和网状层胶原纤维排列方向趋向一致，均与表皮平行，密度均增加，这些胶原纤维排列和密度的病理改变势必影响皮肤正常的生物力学特性。

本试验通过偏振光影像技术对离体胶原纤维进行了成像和定量检测。传统方法对离体组织胶原纤维的检测主要是进行病理染色，但这种方法不能定量检测胶原纤维的排列和密度。液晶偏光影像系统通过特有的液晶补偿光学元件可以将偏振光波产生的光程差信号转变为电信号，再通过软件在监测器上还原成明暗不同的光信号。而且液晶偏光成像采用近似圆偏振光片，可弥补传统线偏振光的不足，无论双折射的物质取向如何，均可以对物质的方位角变异程度和密度定量分析。胶原纤维具有双折光性，在离体组织经脱蜡后，不需任何染色条件下，液晶偏振光影像技术可以对胶原纤维检测，并通过系统自带软件对方位角变异程度和密度进行定量分析［23-24］，而胶原纤维排列和密度的分析对于诊断瘢痕具有重要的意义。

虽然偏振光影像技术对胶原纤维的检测拥有传统方法不可比拟的优点，但无创、活体检测才能反映出更多的生物医学信息。SHG成像技术是新近发展起来的激光扫描非线性光学显微术，以生物组织非中心对称性的内源性信号为来源，不需进行染色，可以直接原位成像，而且采用近红外的飞秒激光作为光源，对组织探测深、损伤小、分辨率高［25］。二次谐波成像技术不仅可以对活体组织x和y平面进行扫描，同时对z轴方向进行检测，从而实现三维成像。胶原纤维具有强烈的二阶非线性极化率和结构非中心对称性，可以产生二次谐波。SHG成像技术可以活体、无创、定量研究胶原纤维的病理变化。目前SHG成像技术广泛应用于药物透皮［26］和癌变组织［27］，而且也逐渐应用到瘢痕胶原纤维的研究中［28-30］。本试验通过SHG成像技术活体、无创检测了烧烫伤小鼠瘢痕乳头层和网状层胶原纤维的病理变化，这为将来在人体无创和定量研究瘢痕提供了方法。

本试验通过SHG和液晶偏振光影像技术从活体皮肤水平面和离体组织矢状面检测烧烫伤小鼠瘢痕胶原纤维排列方向和密度的变化，虽然SHG成像技术与液晶偏振光影像技术物理机制不同，但反映出来的意义相同，均可以反应胶原纤维排列和密度的病理变化。而且本试验发现SHG和液晶偏振光影像技术对胶原纤维的检测结果趋势一致，即瘢痕部位、瘢痕周围乳头层和网状层胶原纤维的排列方向均偏向一致，与表皮平行，胶原纤维密度明显增加，这种结果趋势的相同为仅通过SHG成像技术无创鉴别瘢痕组织提供了可能。总之，通过本研究希望建立一种活体、无创鉴别瘢痕组织的评估方法，为人体预防和治疗瘢痕形成的药物治疗提供检测方法。