不同叶绿素测定方法的比较研究

赵京东，宋彦涛，何 畅，徐鑫磊，乌云娜，李琳琳

(大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605)

高等植物体中叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b，均是参与光合作用的重要色素[1]，其含量的多少是衡量植物光合作用强弱的重要指标[2]。目前，研究者们测量植物体内叶绿素含量主要有两种方法。其一是实验室化学分析，即使用丙酮、乙醇等有机溶剂浸泡植物叶片后，根据叶绿素在溶剂中对特定波长的光有最大吸收，采用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度，再根据相关公式推导即可计算叶绿素含量[3]，但由于该方法所需仪器较多，耗时较长，不适于样品量较多的野外实验。其二是使用便携式SPAD 叶绿素仪，其特点是测量过程中不需试剂，在保证植物与叶绿素仪接触的情况下可直接得出叶绿素的相对含量，即SPAD值，具有无损、实时检测等诸多优点，弥补了传统实验室分析的不足，深受广大学者们的青睐[4]。先前的研究表明，叶绿素仪已在羊草叶片、黑麦草叶片、烟叶、草莓叶片、西葫芦叶片以及小麦叶片等叶绿素含量预测中得到了广泛的应用[5-10]，但不同物种利用SPAD值预测叶绿素含量的模型准确度还存在一些差异[5]，针对同一环境下不同的功能群和物种，便携式SPAD叶绿素仪和传统实验室分析两种方法是否均适用，还需要进一步验证。

本研究对大连民族大学经济技术开发区校区校园内的四类功能群共八种植物的SPAD值和叶绿素含量进行了测定，探讨不同功能群和物种间的SPAD值和叶绿素含量差异以及SPAD 值与叶绿素含量之间是否存在相关性，为利用SPAD值预测不同物种间的叶绿素含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验地概况

实验地点位于大连民族大学经济技术开发区校区(辽宁省大连市经济技术开发区辽河西路18号)校园内。该校区位于大连经济技术开发区中心地带，属暖温带半湿润大陆性季风气候，年均降水量550-950毫米，年均气温10.5℃左右，最高气温35.3℃左右，最低气温在-18.8℃左右。

1.2 实验设计与取样方法

于2017年9月晴朗天气，在大连民族大学校园内选取八种常见物种，共四类功能群，每类功能群两种植物。分别为：乔木：加杨、银杏；灌木：紫丁香、冬青；藤本：紫藤、萝藦；草本：苦卖菜、车前草。采用便携式SPAD(502)叶绿素仪测定和丙酮浸取法测定两种方法进行植物叶绿素的测定。

便携式SPAD叶绿素仪测定法：在植物叶片上随机选取五个位置进行SPAD值的测定，最后取平均值，记录相应数据后采摘装袋，标记后带回实验室进行丙酮法测定。每种植物随机测定30片样品。

丙酮浸取法测定：将带回的鲜叶用打孔器取样并称重(与SPAD测量的叶片相同)，然后放置于标号的试管中，在每个试管中用移液管加入10 ml的80%的丙酮溶液，用封口膜封口置于阴暗处放置48 h。48 h后分别在吸光度663 nm和646 nm下以80%的丙酮为空白测定吸光度，记录数据。采用Lichtenthaler[11]公式计算叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)以及总叶绿素(Ca+b)含量。

1.3 数据分析

将功能群、物种作为固定因子进行一般线性模型分析，不同功能群和物种间进行多重比较(Tukey检验)，采用一般线回归分析度量SPAD和叶绿素之间的线性相关，显著性水平α=0.05。统计分析在SPSS 26中完成，Sigmaplot 12.5和Excel2018作图表。

2 结果与分析

2.1 不同植物之间叶绿素的方差分析

SPAD和丙酮法都能体现不同功能群或物种之间的差异，一般线性模型结果显示：不同功能群和不同物种之间SPAD与叶绿素含量差异极显著(P≤0.001)，见表1。

2.2 不同功能群叶片SPAD和叶绿素含量的差异

从SPAD值来看，四类功能群SPAD值变化范围分别为：乔木：34.04～61.44，灌木：48.10～82.14，藤本：29.38～62.00，草本：28.62～66.36。灌木SPAD值最高，显著高于乔木、藤本及草本(P<0.001)，乔木SPAD值显著高于藤本和草本，藤本和草本之间无差异(图1A)。从叶绿素含量来看，四类功能群叶绿素a含量变化范围分别为：乔木：0.65～2.97 mg·g-1，灌木：0.52～2.75 mg·g-1，藤本：0.03～1.09 mg·g-1，草本：0.39～1.80 mg·g-1。乔木和灌木叶绿素a含量最高，其次为藤本，草本叶绿素a含量最低(P<0.001)(图1B)；叶绿素b含量变化范围分别为：乔木：0.01～1.34 mg·g-1，灌木：0.09～1.16 mg·g-1，藤本：0.02～1.99 mg·g-1，草本：0.07～0.59 mg·g-1。藤本叶绿素b含量最高，显著高于乔木、灌木及草本(P<0.001)，而乔木、灌木以及草本间无差异(图1C)；总叶绿素含量变化范围分别为：乔木：0.79～3.74 mg·g-1，灌木：0.62～2.96 mg·g-1，藤本：0.41～2.08 mg·g-1，草本：0.49～2.20 mg·g-1。乔木和灌木总叶绿素含量最高，藤本和草本最低(P<0.001)，如图1。

2.3 不同物种叶片SPAD和叶绿素含量的差异

从SPAD值来看，八种植物SPAD值变化范围分别为：加杨：34.04～58.36，银杏：46.66～61.44，紫丁香：48.10～62.66，冬青：63.54～82.14，紫藤：34.20～62.00，萝藦：29.38～49.28，苣荬菜：35.34～66.36，车前：28.62～52.28，SPAD值由高到低表现为冬青>紫丁香>银杏>苣荬菜>紫藤>加杨>萝藦>车前(图2A)。从叶绿素含量来看，八种植物叶绿素a含量变化范围分别为：加杨：0.97～2.97 mg·g-1，银杏：0.65～1.51 mg·g-1，紫丁香：1.15～2.75 mg·g-1，冬青：0.52～1.71 mg·g-1，紫藤：0.03～0.15 mg·g-1，萝藦：0.36～1.09 mg·g-1，苣荬菜：0.54～1.80 mg·g-1，车前：0.39～1.03 mg·g-1。叶绿素a含量由高到低表现为紫丁香>加杨>苣荬菜>银杏>冬青>萝藦>车前>紫藤(P<0.001)(图2B)；叶绿素b变化含量分别为：加杨：0.06～1.34 mg·g-1，银杏：0.01～0.32 mg·g-1，紫丁香：0.20～1.16 mg·g-1，冬青：0.09～0.48 mg·g-1，紫藤：0.42～1.99 mg·g-1，萝藦：0.02～0.59 mg·g-1，苣荬菜：0.07～0.59 mg·g-1，车前：0.08～0.24 mg·g-1。叶绿素b含量由高到低表现为紫藤>加杨>紫丁香>苣荬菜>冬青>萝藦>车前>银杏(P<0.001)(图2C)；总叶绿素含量变化范围分别为：加杨：1.09～3.74 mg·g-1，银杏：0.79～1.67 mg·g-1，紫丁香：1.89～2.96 mg·g-1，冬青：0.62～2.19 mg·g-1，紫藤：0.46～2.08 mg·g-1，萝藦：0.41～1.38 mg·g-1，苣荬菜：0.62～2.20 mg·g-1，车前：0.49～1.22 mg·g-1。总叶绿素含量由高到低表现为加杨>紫丁香>苣荬菜>紫藤>冬青>银杏>萝藦>车前(P<0.001)，如图2。

2.4 不同方法间的回归关系

对四类功能群共八种植物叶片SPAD值与叶绿素含量进行线性回归分析，结果见表2。乔木功能群的加杨和银杏SPAD值与叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量之间均存在显著线性关系；灌木功能群的紫丁香SPAD值与叶绿素a和总叶绿素含量之间存在显著线性关系，与叶绿素b含量之间无显著线性关系，而冬青SPAD值与叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量之间均存在显著线性关系；藤本功能群的紫藤SPAD值与叶绿素a之间存在显著线性关系，与叶绿素b和总叶绿素含量之间无显著线性关系，萝藦SPAD值与叶绿素a之间存在显著线性关系，与叶绿素b和总叶绿素含量之间无显著线性关系；草本功能群的苣荬菜SPAD值与叶绿素b和总叶绿素含量之间存在显著线性关系，与叶绿素a之间无显著线性关系，车前SPAD值与叶绿素a和总叶绿素含量之间存在显著的线性关系，与叶绿素b之间无显著线性关系。

表2 不同物种叶绿素含量与SPAD值的关系

续表2 不同物种叶绿素含量与SPAD值的关系

2.5 不同物种间叶绿素a和叶绿素b比值的差异

不同物种间叶绿素a/b值均存在极显著差异(P<0.001)。银杏叶绿素a/b值最高，紫藤叶绿素a/b值最低，其余六种植物间无显著差异，如图3。

3 讨 论

叶绿素含量是植物生理的重要指标之一，反映了植物光合能力、发育阶段、生长状况、生理代谢水平及营养条件[4]。本研究发现，不同功能群和物种间SPAD值和叶绿素含量表现出极显著差异(图1～2)，这说明便携式SPAD叶绿素仪和80%丙酮浸取法(鲜叶)两种方法均适用，但变化趋势不同。SPAD叶绿素仪通过二极管发射660 nm和940 nm 的红光和近红光进行叶绿素 SPAD 值的测定，SPAD值是一个无量纲的比值，在测定植物叶片相对叶绿素含量的同时具有对叶片无损伤的优势[2]，但不同物种利用 SPAD 值预测叶绿素含量的模型准确度还存在一定差别，需根据测定目标的不同进行具体分析[5]。而传统实验室方法虽可避免物种间模型差异，但耗时较长，野外实验中样品存放时间过长也会导致叶绿素流失，王凯等[12]研究发现，当以单位鲜重计算叶绿素含量时，含水量高的叶片往往会低于含水量低的叶片，结果会产生一定误差，因此，两种方法间存在差异。本实验测定了八种植物共24组叶绿素数据(表2)，其中与SPAD值达到显著线性关系的有17组，未达到显著线性关系的有7组，其中包括叶绿素a一组，叶绿素b四组，总叶绿素两组，且除加杨和苣荬菜外，其余六种植物SPAD值与叶绿素a回归系数(R2)均高于叶绿素b，说明SPAD值与叶绿素b的相关性不及叶绿素a。这可能与SPAD叶绿素仪的吸收波长有关(660 nm和940 nm)，叶绿素a和叶绿素b的吸收峰在663 nm和645nm附近[12-13]，相对于叶绿素b，叶绿素a的吸收峰更接近于仪器测定波长，因此线性回归系数更高。

在SPAD值与叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量呈显著线性关系的三种植物中，SPAD值：冬青>银杏>加杨，总叶绿素含量：加杨>冬青>银杏，在八种植物当中，加杨的SPAD值与叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量回归系数均最高，说明SPAD值可准确预测加杨叶片中叶绿素含量，且加杨和紫丁香叶片中叶绿素总量最高。这可能是由于加杨、银杏以及紫丁香属高大乔木，具有较宽的生态位，优先对光能进行利用和截留，但银杏的总叶绿素含量却远远不及加杨和紫丁香。梁俊林等[14]对9-11月份银杏叶变色期的研究发现，银杏叶从微黄变全黄总叶绿素含量从3.999 mg·g-1降到0.077 mg·g-1，本实验中银杏的总叶绿素含量为1.89～2.96 mg·g-1，已属于微黄期，但单从外观不易分辨，银杏叶片中叶绿素的不断降解是其逐渐变黄的成因[14-15]，导致结果偏低。

在本研究中，除紫藤外，其余七种植物叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量的变化趋势一致，叶绿素a含量均显著高于叶绿素b含量，而紫藤的叶绿素a却显著低于叶绿素b含量，导致叶绿素a与叶绿素b比值最低，为0.06，远低于其他物种(图3)，这是一个有趣的发现。Hoflacher等[16]研究发现，在叶绿素a与叶绿素b比值中，阴生植物叶绿素a/b值往往小于3，说明紫藤能够忍受一定程度的遮荫环境，而除紫藤外，其余七种植物均适合生活在光线充足的向阳处。在研究区内，紫藤位于遮荫位置，且叶片多呈蓝紫色，张春牛[17]研究发现叶绿素b在蓝紫光部分的吸收带较宽，而阴生植物能在散射光下更好的利用蓝紫光，与本实验结果吻合。

4 结 论

通过对四类功能群即八种植物的SPAD值和叶绿素含量进行了测定比较和相关分析，不同功能群和不同物种之间SPAD与叶绿素含量差异极显著(P≤0.001)，但趋势不同。其中加杨、银杏以及冬青叶片SPAD值与叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量间均存在显著线性正相关性，而紫丁香、紫藤、萝藦、苣荬菜以及车前则存在无显著关系。因此，在测定不同物种间叶绿素时，如两种方法间存在显著相关性，优先选择方便、快捷且无损的便携式SPAD叶绿素仪；如出现无显著关系的结果，在选择实验方法时，可根据具体研究目的和内容而定。