超声结合4,4-双甲基姜黄素对DNA损伤的实验研究

刘冰弥，张 闯，李 丽,3，刘洋成，栾佳思，刘 宇,3

(1.辽宁大学药学院，辽宁沈阳110036；2.辽宁新药研发重点实验室，辽宁沈阳110036；3.辽宁省天然产物制药工程技术研究中心，辽宁沈阳110036）

0 引 言

姜黄素(Curcumin)是从中国传统中草药的根茎中提取的一种成分，对多种肿瘤细胞具有抗增殖活性和诱导凋亡作用，在体内可抑制肿瘤发生，具有良好的临床应用潜力[1]。为提高其体内抗癌活性，人们对姜黄素结构进行了大量的修饰和改造，出现了许多活性显著的姜黄素类似物[2]，但是大多数类似物因体内血药浓度过低或消除迅速而不能发挥治疗作用[3]。声动力疗法(SonoDynamic Therapy,SDT)是近年兴起的一种极具临床应用前景的肿瘤治疗新方法，利用肿瘤细胞和正常细胞在氧化还原平衡方面的差异，通过超声波照射声敏剂(声敏药物)产生协同作用，提高肿瘤细胞内的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平，导致细胞死亡[4-6]，这种协同作用产生的效果比单独药物作用更强。因而，使用更小剂量的声敏药物结合超声波照射就能达到治疗效果。针对大多数抗癌活性显著的姜黄素类似物都存在体内血药浓度低的缺点，设想从姜黄素类似物中筛选出声敏剂，利用超声与低浓度姜黄素类似物的协同作用达到抗肿瘤效果。

姜黄素、羟基乙酰化姜黄素、4,4-双甲基姜黄素(dimethylcurcumin,DMCU)的分子结构如图1所示。研究发现姜黄素及其衍生物羟基乙酰化姜黄素(见图 1)均具有声敏性[7-8]。我们合成的姜黄素类似物 4,4-双甲基姜黄素[9]，其化学结构与姜黄素及羟基乙酰化姜黄素差异较小，因此推测DMCU具有声敏性。先前的研究已经证实了DMCU可与小牛胸腺双链DNA以沟槽结合模式形成稳定的复合物，且两者的距离在 2～8 nm 范围内[10]。研究表明，当 ROS与DNA之间的距离在1.5～9 nm范围内时，可直接攻击DNA，造成DNA损伤[11]。因而，认为超声结合DMCU产生的 ROS可有效损伤 DNA，从而引起DNA构象发生变化。为了验证上述推测，本文以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作为检测 DNA 分子构象变化的荧光探针，利用荧光光谱技术研究超声波照射结合 DMCU对 DNA的损伤作用，从而为ROS的产生及其作用提供依据。另一方面，鉴于ROS 生成被认为是SDT的主要机制，本文在模拟人体生理条件下采用氧化-萃取分光光度法[12]检测超声过程中产生的ROS，并使用ROS清除剂鉴别ROS种类，从而对超声作用条件下 DMCU损伤DNA的声化学机制进行初步探讨。

图1 姜黄素、羟基乙酰化姜黄素、4,4-双甲基姜黄素(DMCU)的分子结构Fig.1 The molecular structures of curcumin and hydroxyl- acetylated curcumin,and 4,4-dimethylcurcumin(DMCU)

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

KQ-500DE型数控超声仪(昆山超声仪器有限公司)，频率为 40 kHz，功率为 200 W。UV-2550紫外可见分光光度计(Shimadzu Co.,日本)；F-7000荧光光谱仪(Hitachi High-Technologies Co.,日本)；AL204电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；PHS-3TC酸度计；微量进样器。

脱氧核糖核酸(小牛胸腺 DNA，北京奥博星生物技术责任有限公司产品)储备液浓度为7.5×10-5mol·L-1；DMCU(实验室自制)储备液浓度为2.5×10-3mol·L-1；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris,AR,天津市博迪化工有限公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI,AR,上海浩然生物技术有限公司)浓度为 7.5×10-5mol·L-1；二苯卡巴肼(DPCI,AR,国药集团化学试剂有限公司)储备液浓度为1.0×10-2mol·L-1；抗坏血酸(Vc,AR,国药集团化学试剂有限公司)；甘露醇(D-Mann,AR,天津博迪化工股份有限公司)；L-组氨酸(L-His,AR,天津市光复精细化工研究所)，三种清除剂的储备液浓度均为5×10-2mol·L-1。实验用水为二次蒸馏水，其余试剂均为市售分析纯。实验中所有超声作用过程均避光操作，水温均保持在35～37 ℃。

2.2 实验方法

2.2.1 DMCU的降解及超声时间的研究

将7个规格均为25 mL的容量瓶，编号为1～7号。先向每个容量瓶加入相同体积的DMCU储备液，用缓冲液定容。将上述溶液分别转移至规格为50 mL的锥形瓶中，封口后，超声作用分别0、1、2、3、4、5、6 h。超声作用结束后，测定紫外吸收光谱。

2.2.2 超声波照射DMCU溶液产生ROS的测定

取6个规格均为50 mL的容量瓶，分别标为1～6号，依次向其中加入不同体积的DMCU储备液，再加入同体积DPCI储备液，用缓冲溶液定容。移取25 mL上述溶液至规格为50 mL的锥形瓶中，封口后超声作用 3 h。剩余溶液避光保存。在超声作用过程中每隔半小时将每个锥形瓶按顺时针方向移位一次，消除因不同位点超声强度略有差异导致的机械误差。超声作用结束后，用苯与四氯化碳的混合溶液(体积比1:1)对两组溶液进行萃取，移取有机层溶液测定紫外吸收光谱。实验重复3次。

2.2.3 超声作用前后DMCU对DNA损伤程度比较

取6个规格均为25 mL的容量瓶，编号为a～f。向a、b、c、d中分别加入同体积的DMCU储备液，再向c、d、e、f中加入同体积的DNA储备液，用缓冲液定容。将 b、d、f中的溶液分别转移至规格为50 mL的锥形瓶中，封口后超声作用3 h，a、c、e瓶避光保存。超声作用结束后，检测a～f溶液的紫外吸收光谱。

另取4个规格均为25 mL的容量瓶，编号为g～j，分别加入同体积DNA储备液，在g和h中加入同体积DMCU储备液，然后向4个瓶中加入缓冲液，使得每瓶中的溶液体积均为20 mL。将j和h中的溶液转移至规格为50 mL的锥形瓶中，封口超声作用 3 h。另外两瓶溶液避光保存。超声作用结束后，分别向这4瓶溶液中加入DAPI储备液。检测a～d及g～j溶液在275 nm波长处激发的荧光光谱。

2.2.4 DMCU浓度对DNA损伤程度的影响

取7个规格为50 mL的容量瓶，编号为a～g。依次向其中加入不同体积 DMCU储备液，再加入同体积DNA储备液，最后加入缓冲液使每瓶中的溶液体积均为40 mL。分别移取上述溶液20 mL至规格为50 mL的锥形瓶，封口超声作用3 h。在超声作用过程中，每隔半小时将锥形瓶按顺时针方向移动一次，以消除不同位点对超声强度造成的误差。剩余溶液避光保存。超声作用结束之后，分别向这14份溶液中加入同体积的DAPI储备液，检测275 nm波长处激发的荧光光谱。

2.2.5 ROS的种类

选择产生 ROS量最大的 DMCU浓度进行实验。取4个50 mL容量瓶，先加入一定体积DPCI和DMCU储备液，再向其中3瓶分别加入同体积的Vc、L-His和D-Mann储备液，剩下一瓶溶液不加清除剂。超声作用3 h后对所有溶液进行萃取，移取有机层溶液测定紫外吸收光谱。实验重复3次。

3 结果与讨论

3.1 DMCU的降解及超声时间的确定

浓度为 1.5×10-5mol·L-1的 DMCU 溶液在不同超声作用时间的紫外吸收光谱以及在波长 356 nm和 280 nm 处的吸光强度如图 2(a)、2(b)所示。在200～550 nm波长范围内，DMCU在波长 356 nm处出现了最强吸收峰。经超声波照射后 DMCU发生了降解，在波长280 nm附近出现了新的吸收峰，可能是含有双α,β-不饱和酮结构的DMCU分子降解生成了含单个 α,β-不饱和酮结构的化合物分子。根据图 2(b)可获得DMCU在这两个波长处的吸收强度随超声作用时间变化曲线。如图2(b)所示，随着超声波照射时间的增加，DMCU在波长356 nm处的吸收强度迅速下降，2 h后趋于稳定，表明DMCU已经完全降解；在波长280 nm处的吸收强度随着超声时间的增加而升高，3 h后吸收强度存在较明显的波动。因此，将后续实验中的超声作用时间设定为3 h。

图2 DMCU降解的吸收光谱以及DMCU在波长356 nm和280 nm处的吸光度随超声照射时间的变化Fig.2(a)Absorption spectra of DMCU degradation and(b)the absorbance changes of DMCU solution at 356 nm and 280 nm with different ultrasonic irradiation times

3.2 超声作用条件下DMCU浓度与ROS的产量关系

氧化-萃取分光光度法是一种简单有效的检测ROS的方法，水溶性的DPCI可被ROS氧化成不溶于水的 1,5-二苯基卡巴腙(Diphenylcarbazone,DPCO)，通过有机溶剂萃取出的 DPCO在波长563 nm处，吸收光谱有最大吸收峰，且吸收强度与ROS的产量呈正相关性[12]。图3(a)描述了超声波照射不同浓度DMCU溶液的过程中生成的DPCO的吸收光谱图。由图 3(a)中可以看出，超声照射 3 h的有机层溶液均在波长563 nm处有明显的吸收峰，表明溶液中均产生了ROS。此外，单纯超声作用虽然也能使溶液中产生 ROS，但产量较低，加入DMCU后ROS明显增多。图3(b)中比较了超声照射和未经超声照射两种情况下，不同浓度的DMCU溶液在波长 563 nm处的吸收值，DPCI浓度为1.0×10-3mol·L-1，超声作用时间为 3 h，数据用三个实验的平均值±标准差表示。如图 3(b)所示，未经超声照射的不同浓度的DMCU溶液在波长563 nm处的吸收值差别不大，但与超声照射组相比差异明显。另外，随着DMCU浓度增大，ROS产量逐渐升高，当 DMCU 浓度为 1.5×10-5mol·L-1时，ROS产量达到最大，原因可能是当浓度高于1.5×10-5mol·L-1后，溶液中过多的 DMCU 阻滞了声致发光的传导，导致产生的ROS减少。

图3(a)浓度为1.0×10-3mol·L-1的DPCI与不同浓度DMCU混合的溶液中产生的DPCO的吸收光谱；(b)在3小时超声照射和无超声照射下DPCO在563 nm处的吸光度变化Fig.3(a)Absorption spectra of the generated DPCO in the mixed solutions of DPCI(1.0 × 10-3mol·L-1)and DMCU(different concentrations)and(b)the absorbance changes of DPCO at 563 nm under 3 hours of ultrasonic irradiation or non-irradiation

3.3 超声照射前后DMCU及DMCU+DNA溶液的吸收光谱

在 DNA溶液和 DMCU溶液浓度均为1.5×10-5mol·L-1，DNA、DMCU 及 DNA+DMCU溶液在超声照射和无照射条件下的吸收光谱如图 4所示。从图4可知，单独DNA溶液的特征吸收峰值在261 nm处，而DNA与DMCU混合液在波长261 nm处的吸收强度显著提高，说明加入 DMCU后的 DNA溶液发生了明显的增色效应，表明DMCU与DNA形成了复合物DNA-DMCU。超声作用条件下单独DNA溶液相较于无超声照射的溶液表现出增色效应，表明DNA受到了损伤，其构型发生了变化。其原因可以解释为超声照射过程中溶液中产生了具有高氧化活性的ROS，它们在短时间内攻击近旁的DNA分子，使得DNA分子的空间结构遭到破坏，双螺旋结构展开，DNA的碱基对被暴露出来，导致其特征吸收峰处的吸收强度增大[13]。此外，由于DMCU的降解产物与DNA的吸收谱带部分重叠，因而不能通过比较超声前后DNA与DMCU混合溶液在波长261 nm处附近的吸收强度判断DNA的受损程度。因此，我们借助荧光探针通过荧光光谱法来进行比较。

图4 DNA、DMCU及DNA+DMCU溶液在3小时超声照射和无照射条件下的吸收光谱Fig.4 Absorption spectra of DNA,DMCU and DNA+DMCU solutions under 3 hours of ultrasonic irradiation or nonirradiation

3.4 超声照射前后DMCU存在下DNA损伤程度的对比

文献[10]已经证实，在模拟生理条件下DMCU与DNA可形成复合物DNA-DMCU，且其可与DNA小沟结合的荧光探针DAPI发生竞争取代反应。在360 nm的激发波长下，DNA-DAPI复合物的最强发射峰出现在波长 460 nm 附近[14]，超声前后的DMCU溶液在波长400～500 nm范围内均有荧光，因而对复合物的荧光强度可产生干扰。当将激发波长设定为275 nm，DNA、DMCU、DAPI溶液浓度均为 1.5×10-5mol·L-1时，超声波照射前后的 DNA与DMCU混合溶液c与d及单纯DMCU溶液a与b的最强荧光发射峰均出现在波长350 nm附近，而DNA- DAPI复合物在波长463 nm处出现最强发射峰(见图5)。因此，我们选择275 nm作为激发波长，以消除其他物质对DNA-DAPI复合物荧光强度的影响。

由图5可知，以DAPI作为荧光探针，超声照射的DNA溶液j相较于无超声照射的DNA溶液i在波长 463 nm处的荧光强度有所下降，表明单独超声波照射仅对DNA分子造成轻微损伤。此外，在无超声照射条件下，先将DMCU加入到DNA溶液，然后再加入DAPI荧光探针，由此形成的混合溶液 g在波长 463 nm处的荧光强度明显低于DNA+DAPI混合溶液i，表明在溶液g中，DMCU 先与DNA发生了相互作用，与一定量的DNA分子形成了几乎无荧光的复合物 DNA-DMCU，后加入的DAPI与该复合物上DMCU发生竞争取代反应，将一部分 DMCU取代下来，同时形成强荧光的DNA-DAPI复合物。由于溶液i和g中DNA浓度相同，则g中与DAPI相结合的DNA分子数量少于 i中的 DNA分子数量，因而形成强荧光的DNA-DAPI复合物少于i溶液。然而，超声照射后的DNA+DMCU混合溶液再加入DAPI荧光探针，由此形成的混合溶液h在波长463 nm附近的荧光强度比无超声照射的混合溶液g更低。因此可以推测，除了DMCU结合造成的DNA损伤外，超声结合DMCU产生的协同效应也对DNA产生了损伤。通过4种溶液体系在463 nm附近的荧光强度值可知，由溶液 g→h的荧光强度差值大于由溶液 i→g的差值，表明超声结合 DMCU产生的协同效应可使DNA发生严重损伤，且效果比单独使用超声波照射或单独使用DMCU更好。

3.5 DMCU浓度对DNA损伤程度的影响

为了进一步考察超声条件下 DMCU浓度对DNA损伤的影响，以DAPI作为荧光探针通过荧光光谱比较了超声照射(3 h)和无超声照射条件下DNA的损伤程度，结果如图6所示。实验中，DNA和 DAPI的浓度均为 1.5×10-5mol·L-1。在无超声波照射和超声波照射(3 h)两种条件下，在波长463 nm处的荧光强度都随着 DMCU浓度升高而降低，表明随着DMCU浓度的增加，DMCU与结合在DNA分子上的荧光探针 DAPI发生了竞争取代，致使DNA-DAPI复合物减少，从而导致荧光强度降低，但超声照射组荧光强度降低的程度比未照射超声组更大。以上结果表明，在一定时长的超声波照射条件下，随着DMCU浓度升高，ROS产量增多，因而有更大的几率破坏 DNA分子，导致在波长463 nm处的荧光强度降低，为超声结合DMCU协同产生的ROS对DNA造成了进一步损伤的结论提供了有力的证据支撑。

图6 在3小时超声照射和无照射条件下，以DAPI为探针的不同浓度DMCU与DNA混合溶液在463 nm处荧光强度对比Fig.6 Comparison of the fluorescence intensity at 463 nm of the mixed solution of DNA and DMCU(different concentrations)with DAPI as a probe under 3 hours of ultrasonic irradiation or non-irradiation

3.6 ROS种类的鉴别

为了鉴定ROS种类，本文选取Vc、L-His和D-Mann三种ROS清除剂进行研究。不同类型ROS清除剂对DPCO吸收值的影响如图7(a)所示。

实验中 DPCI浓度为 1.0×10-3mol·L-1，DMCU浓度为 1.5×10-5mol·L-1，D-mann、L-His、Vc 的浓度为2.0×10-3mol·L-1，作用时间为3 h。数据用3个实验的平均值±标准差表示。∗表示P＜0.05，与对照溶液(DMCU+DPCI+US)相比有显著差异，NS表示D-Mann组与L-His组之间无显著差异。Vc可以清除所有种类的ROS[15]；L-His是单线态氧(1O2)和羟基自由基(·OH)的清除剂[16]；而D-Man则只能清除溶液中的·OH[17]。

如图7(a)所示，在加入Vc后，DPCO吸收值明显降低，降低的程度与ROS清除剂对不同种类ROS清除的程度有关，因此可推测混合溶液中将 DPCI氧化为DPCO的物质主要为ROS。

根据图7(b)，经计算可知，L-His与D-Man两种清除剂对 DPCO的吸收值之比P﹥0.05。因此，二者对DPCO吸收值的影响并无显著差别，表明超声结合DMCU产生的ROS主要含有·OH。最近，香港中文大学的XU C S小组分别用1O2清除剂叠氮化钠和·OH清除剂硫脲证实了经超声波照射的姜黄素溶液中产生了1O2和·OH两种类型的ROS[18]，与本实验结果具有部分一致性。此外，有研究发现单纯对脱氧水超声产生的ROS类别主要为1O2，结合本实验结果，我们认为·OH的产生与超声介导DMCU的降解相关。

图7(a)在3小时超声照射和存在不同ROS清除剂的条件下DPCI-DMCU混合溶液产生的DPCO的吸收光谱；(b)不同ROS清除剂对563 nm处DPCO 的吸光度的影响Fig.7(a)Absorption spectra of the generated DPCO of DPCIDMCU mixed solutions in the presence of different ROS scavengers and 3 hours of ultrasonic irradiation and(b)the effects of the different ROS scavengers on the absorbance of DPCO at 563 nm

4 结 论

本文以DAPI为荧光探针，利用荧光光谱技术研究了 4,4-双甲基姜黄素(DMCU)存在条件下超声波照射对DNA的损伤，考察了药物浓度对DNA损伤程度的影响，并对相关机制进行了初步探索。结果表明，超声结合DMCU产生的协同效应对DNA损伤的程度比单纯 DMCU和单纯超声都要大。声化学机制研究表明，超声与 DMCU协同作用过程中种类为羟基自由基的活性氧的产生与超声介导DMCU的降解相关。本论文的研究结果一方面尝试为天然活性产物的药物化学研究结果开辟新的应用领域，另一方面希望为新型声敏剂的筛选和开发提供理论依据和实践基础。