VE-cadherin 在烧伤早期创面加深中的表达*

胡清泉，邓如非，张友来

(南昌大学第一附属医院烧伤中心，南昌330006)

创面修复是烧伤治疗的永恒主题[1]。 机体对于热力损伤最初反应包括热力直接导致的蛋白失活和细胞凋亡， 随后是炎症反应和缺血导致的进行性损伤， 后两者是导致早期烧伤创面加深的主要原因之一。烧伤创面加深最早开始于伤后3h，伤后6h 即可见创面明显加深的变化，24h 更明显，甚至持续到伤后48h 或72h[2]。 早期如何判断并预防深Ⅱ°创面进一步加深是烧伤治疗中必须重视、 但也是目前亟需研究解决的临床难点之一[3]。

血管内皮钙粘附蛋白 （vascular endothelial cadherin,VE-cadherin） 作为血管内皮细胞间的主要连接蛋白，在内皮细胞连接、信号传导、血管的稳定、 抑制细胞凋亡与减少中性粒细胞在组织间隔的聚集均起不同的作用[8,9]。其主要的功能之一是通过促使同型细胞之间相互粘附， 从而达到维护内皮细胞的完整性[4-7]。 VE-cadherin 的结构和功能异常会导致内皮细胞粘附连接解离， 适度的内皮细胞通透性增加可以促进毛细血管的生长， 但大量内皮细胞通透性增加可造成局部组织水肿、细胞缺血缺氧，功能受限。 本研究对不同时间段不同创面中VE-cadherin 表达量进行检测， 旨在探讨VE-cadherin 在烧伤早期创面加深中的表达水平变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠36 只（生产厂家：湖南斯莱克景达实验动物有限公司， 许可证号：SCXK （湘）2016-0002)。

1.2 铜梳状动物烫伤模型造模 提前准备：将动物称重， 用10%的水合氯醛按350mg/kg 剂量腹腔内注射麻醉， 麻醉后用脱毛膏将背部毛发脱干净备用。烫伤：烫伤深Ⅱ°组将麻醉好的大鼠放置于实验台上，助手将大鼠扶好，保持即将烫伤区域的平整，将6mm 间隙铜梳烫伤器浸没预先烧开的沸水中，均匀加热5min，用止血钳拿出，沾干，立即置于大鼠背部中线两测旁开0-5cm 处皮肤，不施加压力，制成烫伤模型；正常组大鼠不予以烫伤处理。护理：烫伤后大鼠烫伤处涂予以单层医用凡士林油纱布覆盖创面，烫伤后3h 观察创面大体淤滞面积，若发生出血点或瘀斑形成等则视为坏死即属于创面加深组，所有创面全程每日更换凡士林油纱布覆盖保持持续保护状态。

1.3 实验分组 ⑴正常对照组（control）；⑵烫伤深II°组（非加深组）；⑶烫伤III°组（加深组）。

1.4 实验方法

1.4.1 HE 染色 取组织用4%多聚甲醛固定做HE染色样本。 组织流水冲洗数小时， 经70%、80%、90%乙醇溶液梯度脱水，无水乙醇、二甲苯1:1 混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。石蜡包埋:二甲苯和石蜡1:1 混合液15min，再分别放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡50-60min。 切片：将石蜡切片、烤片、脱蜡，水化。 染色：苏木精水溶液中染色3min，盐酸乙醇分化液分化15s，稍水洗，返蓝液返蓝15s，流水冲洗，放入伊红液中染色3min，再次流水冲洗，脱水，中性树脂封片后待镜检。

1.4.2 免疫组化 烤片，脱蜡，水化。抗原修复：将切片放入修复盒中，加入抗原修复液(柠檬酸缓冲液)置于高压锅加热后自然冷却，弃去抗原修复液，切片进行PBS 淋洗；封闭内源性过氧化物酶：将切片移入湿盒中，用新鲜配制的3%双氧水，室温孵育10min，PBS 浸洗玻片3 次×5min， 吸水纸吸干组织周围的PBS；封闭：在玻片上滴加5%BSA，37°C 封闭30min。 一抗孵育： 吸水纸吸掉组织周围的封闭液，滴加足够量的稀释好的一抗VE-cadherin（1:200）放入湿盒中，4 °C 孵育过夜；二抗孵育：取出4°C 孵育过夜湿盒， 室温静置45min，PBS 浸洗玻片3 次×5min，滴加辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)（1:100），37 °C 孵育30min，PBS 充分淋洗。 DAB 显色： 在显微镜下掌握染色程度，PBS 或自来水冲洗1min ；苏木精复染3min，盐酸酒精分化，返蓝，流水冲洗1min，脱水、封片后待镜检。免疫组化评分：用Image J pro6.0 中平均光密度值（IOD）采集VEcadherin 蛋白表达量，导出GraphPad Prism 作柱状图。

1.4.3 Western blot 取各组加入相应的裂解液中，4℃裂解30min 后10000 rpm/min 离心10min，小心吸取上清液，得总蛋白。 BCA 试剂盒进行蛋白浓度测定。 蛋白变性、上样、电泳1-2 h，湿法转膜30-50min。 4℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1-2 h。在膜上滴加ECL 曝光液，曝光。用“Image J”软件进行灰度分析。

1.5 观察指标 观察VE-cadherin 蛋白的表达。

1.6 统计学分析 Image J Plus 6.0 检测免疫组化VE-cadherin 表 达 量 平 均 光 密 度 值 （IOD）及Western Blot 蛋白灰度值， 采用SPSS 19.0 进行统计分析， 多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnet 检验。采用Student t 检验分析创面组与对照组的统计学意义， 以P＜0.05 作为显著性差异。

2 结果

2.1 HE 结果 共11 只（加深组）大鼠出现创面加深，13 只（非加深组）未加深，图1 所示：正常对照组各时间点皮肤组织排列整齐，非加深组（Ⅱ°）创面可见明显炎性细胞浸润、浆液及纤维素渗出，皮肤成纤维细胞数量的增加随着时间的延长开始修复。 加深组（III°）创面皮肤组织大量细胞变性、坏死，炎症细胞浸润，随着时间增加肉瘤组织变多，纤维束断裂，纤维化增生。

图1 HE 染色

2.2 免疫组化结果 如图2 所示所示， 在时间点6h、12h、24h、48h 上，与正常对照组相比，非加深组（Ⅱ°）和 加深组（III°）创面皮肤组织VE-cadherin蛋白表达显著增加（P＜0.05）。

图2 免疫组化

2.3 Western Blot 结果 如图3 所示，在时间点6h、12h、24h、48h 上，与正常对照组相比较，非加深组（Ⅱ°）和 加深组（III°）创面皮肤组织VE-cadherin蛋白表达显著增加，其中加深组（III°）创面皮肤组织VE-cadherin 蛋白表达高于II°烫伤组， 差异具有统计学意义（*P＜0.05）。

图3 Western blot

3 讨论

烧伤深Ⅱ°创面早期普遍容易出现创面进行性加深现象，其加深原因较为复杂，目前仍被广泛研究中[10]。有文献显示[11，13]，创面加深可能与毛细血管内皮细胞通透性调控存在相关性。 烧伤后血管内皮细胞通透性增加,出现炎症细胞（如中性粒细胞、IL-8 等）在组织间隙聚集，当发生过度炎症反应会导致组织进一步损害,创面加深[4]。 VE-cadherin 是血管内皮细胞表面特异的跨膜黏附蛋白， 特异表达于内皮细胞的钙黏附素，研究显示VE-cadherin在保持血管的完整性，调节内皮细胞间的通透性，白细胞渗出以及细胞内的信号传导等各方面具有关键作用[12]。 VE-cadherin 表达增加可间接反映血管内皮细胞损伤和血管通透性增加，VE-cadherin水平能够反映血管内皮损伤程度， 并可对损伤程度进行量化[8]。 由此可推测，VE-cadherin 的表达与烧伤创面加深可能存在一定关系， 本试验拟探讨VE-cadherin 在烧伤早期创面加深后表达量的变化，为临床诊断、防治烧伤早期创面加深提供指导意见。

本实验中加深组创面皮肤组织出现了大量细胞变性、坏死，明显的炎症细胞浸润，证实了过度炎症反应是导致创面加深的主要因素之一[13]。适度炎症反应可起到促进愈合的作用， 但是过度炎症刺激可能会适得其反； 血管内皮细胞通透性在调节炎症和促进愈合方面具有重要作用， 血管通透性与毛细血管内皮细胞之间的紧密连接、 内皮细胞层的连续性、 毛细血管基底层完整性等因素有关，其中最重要的是内皮细胞之间的紧密连接，而VE-cadherin 是血管内皮细胞黏附连接的主要成分[14]。本实验中免疫组化结果提示烧伤创面加深后创面VE-cadherin 蛋白表达显著增加，且WB 检测显示在早期各时间点与对照组比较非加深烫伤组和加深烫伤组皮肤组织VE-cadherin 蛋白表达显著增加,其中加深III°烫伤组皮肤组织VE-cadherin蛋白表达高于非加深II°烫伤组， 差异具有统计血意义（P＜0.05）。 这表明VE-cadherin 的表达与烧伤早期创面加深有一定关系， 在烧伤早期创面加深中可能起重要作用。且VE-cadherin 的表达变化可能成为判断烧伤早期创面加深的参考指标， 对临床防治烧伤早期创面加深具有一定的临床意义。此外，近年来有研究表明[14]VE-cadherin 相关信号通路还可通过调节血管通透性加速创面愈合。 除了黏附特性之外，VE-cadherin 还参与了调节各种细胞内进程，比如细胞增殖、凋亡与调节血管内皮生长因子受体等的功能， 具体的相关机理仍有待进一步的实验研究揭示。