灵龟八法对肾阳虚家兔免疫功能的影响

赵彩娇 谭敏 叶艺 王曙松 范郁山

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

肾为先天之本，水火之宅，是维持人体生命活动的重要脏腑，具有藏精、主水、纳气三大生理功能，为脏腑阴阳之根本。肾阳又称为命门之火，具有温煦、蒸腾、气化、推动等作用。肾阳不足，出现温煦、蒸腾、气化等功能减退，并出现肾阳虚衰等一系列证候。

肾阳虚证是中医脏腑辨证的一个重要证型，见于多种疾病的过程中，一直为中医界研究的重点。中医理论认为，肾虚是衰老的主因，阳气是生命的根本，肾阳虚与衰老有着密不可分的关系。故本实验拟用肾阳虚模型家兔为研究对象，以血清白细胞介素(IL)-2，免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM为客观指标，观察灵龟八法按时开穴艾炷灸对其含量水平变化的影响。

1 材料与方法

1.1动物分组 选用广西中医药大学动物实验中心提供的健康新西兰家兔40只，8月龄，体重2.0～2.2 kg，雌雄各半(实验动物许可证号为SYXK桂2012-0001)。实验前，所有动物在实验室条件下适应性饲养2 w，实验室要求每天光照与黑暗各12 h(光照时间为7∶00～19∶00)、室温23℃，相对湿度为65%。在此期间自由进食和饮水。饲料由动物实验中心提供。适应性饲养结束后再次称重，按随机区组设计，随机分为空白对照组、模型对照组、灵龟八法治疗组、神阙治疗对照组各10只。

1.2试剂与仪器 (1)药品和试剂：造模用羟基脲片，由齐鲁制药有限公司生产，批号为11204LC，规格为0.5 g/片。IL-2试剂盒、IgA、M、G试剂盒由苏州卡尔文生物科技有限公司提供，规格96T，批号20121001A。(2)主要实验仪器：德国Thermo Electron公司的Thermo离心机，型号ST16R；美国BioTek公司的全波长酶标仪，型号EPOCH BIOTEK；日本三洋电机株式会社的医用低温箱(-80℃)，型号MDF-U7386S；日本三洋电机株式会社恒温箱(CO2培养箱)，型号MCO-18AIC。(3)艾绒：南阳绿莹艾草制品有限公司的三年陈艾，纯度10∶1。

1.3造模方法 羟基脲片用研钵捣碎，用清水配置成500 mg/3 ml的混悬液，充分混匀〔1〕。除空白对照组外，其余组家兔均用羟基脲混悬液空腹灌胃，剂量为700 mg/(kg·d)。连续造模5 d，家兔即出现体重下降、进食量减少、竖毛拱背、掉毛、毛色无光泽、畏寒肢冷、活动减少、神态萎靡、踡卧、尿多、下利清谷等肾阳虚征象。在整个造模过程中实验家兔未出现死亡现象。

1.4干预治疗方法 空白对照组：每天上午只称体重，不灌胃。称完体重后，将家兔取仰卧位，四肢固定于实验台上5 min。模型对照组：每天上午用羟基脲混悬液，剂量700 mg/(kg·d)空腹灌胃后，再将家兔取仰卧位，四肢固定于实验台上5 min。连续造模5 d。灵龟八法治疗组：同模型对照组连续造模5 d，造模结束次日巳时应用灵龟八法按时开穴艾炷灸干预治疗，连续治疗10 d。这10 d的开穴依次是照海、照海、内关、外关、公孙、外关、申脉、公孙、外关、公孙。腧穴定位方法主要参照邓春雷等〔2〕主编《实验针灸学》的“常用实验动物的针灸穴位之定位方法”进行。艾炷制作：将细软艾绒捻紧成为直径约5 mm、高1 cm的圆锥状艾炷，每炷约50 mg。施灸方法：将家兔取仰卧位，四肢固定于实验台上，在灵龟八法当时辰所开穴位上进行艾炷灸，单侧直接无瘢痕灸。根据先阳后阴的原理，先灸左侧穴位，次日再灸右侧穴位，交替进行。施灸时先将施灸部位的体毛剪去，再涂以少量芦荟汁以固定艾炷，并防止烫伤，无瘢痕直接灸，每次连续灸3壮，每壮以家兔全身挣扎为度。每日1次，共治疗10 d。神阙治疗对照组：同模型对照组连续造模5 d，造模结束次日巳时开始进行治疗。将家兔取仰卧位，四肢固定于实验台上，在神阙穴上进行艾炷灸。腧穴定位方法及施灸方法同灵龟八法治疗组，每日1次，共治疗10 d。

1.5标本采集与检测 各组家兔于造模前、造模后、治疗后分别取耳缘静脉血3 ml，2 000 r/min离心10 min，吸取血清置于-80℃冰箱保存待测。采用酶联免疫法测定细胞因子IL-2及IgG、IgA、IgM的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.6生命质量评分 参照《中医虚证辨证参考标准》〔3〕中的肾阳虚诊断标准，采用等级评定积分法自制评分量表，选择进食量、体重、竖毛拱背、掉毛、毛色无光泽、畏寒肢冷、活动减少、神态萎靡、踡卧、尿多、下利清谷等为积分症状。根据症状轻度、中度、重度分别计2、4、8分；有其他症状者计2分，无计0分。

1.7数据统计 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组家兔生命质量评分比较 造模后，空白组未出现肾阳虚的症状；与空白对照组比较，模型对照组、灵龟八法治疗组、神阙治疗对照组生命质量评分明显升高(P<0.01)。造模后灵龟八法治疗组与神阙治疗对照组生命质量评分与模型对照组比较，无明显差异(均P>0.05)。与造模后比较，灵龟八法治疗组和神阙治疗对照组治疗后症状明显改善(P<0.01)，且灵龟八法治疗组优于神阙治疗对照组(P<0.05)。见表1。

表1 造模后及治疗后家兔生命质量评分的变化分)

2.2各组家兔血清细胞因子IL-2、IgG、IgA、IgM比较 造模前4组血清IL-2、IgG、IgA、IgM水平无显著差异(P>0.05)。造模后，模型对照组、神阙治疗对照组、灵龟八法治疗组血清IL-2水平较造模前显著降低，血清IgG、IgA、IgM水平较造模前显著升高与空白组比较有统计学差异(P<0.01)。治疗后，灵龟八法治疗组IL-2水平明显升高(P<0.05)，而神阙治疗对照组的IL-2含量虽略有升高，但无显著差异(P>0.05)，两治疗组组间比较差异显著(P<0.05)，治疗后，灵龟八法治疗组及神阙治疗对照组血清IgG、IgM、IgA含量均下降，且与模型对照组比较有显著差异(P<0.01，P<0.05)，治疗组间比较差异无显著(P>0.05)。见表2。

表2 4组血清IL-2、IgG、IgA、IgM检测结果

3 讨 论

中医中药里是没有“免疫”这一专用术语，但可以从现代免疫学精确的定量检测手段应用中，观察到中医药在免疫领域里的作用〔4〕。中医理论认为“正气存内，邪不可干”，“肾为先天之本”，是人生生不息之根，正气的产生离不开肾阳的温煦，故肾与免疫具有十分密切的关系。肾阳虚证涉及神经、内分泌、物质代谢、生殖、免疫、受体等多个方面，主要表现在全身功能减退及神经-内分泌-免疫网络功能的紊乱〔5〕。操红缨等〔6〕研究发现，肾阳虚多尿模型大鼠CD3+、CD4+百分比，较正常对照组明显减少，CD3+、CD8+百分比，较正常对照组明显增加，说明肾阳虚大鼠的免疫功能紊乱。谭从娥等〔7〕则利用基因表达谱芯片技术探讨肾阳虚证的发生与免疫功能类基因的关联性，结果显示免疫系统反应特别是MHC-Ⅱ类分子介导的抗原加工及提呈过程的异常可能是肾阳虚证发生的主要免疫机制。现代多项研究〔8～10〕显示，通过提高免疫功能可以改善肾阳虚症状，可见，肾阳虚与免疫功能关系密切。

中医作为世界上影响力较大的传统医学，自古以来就对防病延衰极为重视。中医传统的衰老学说主要有〔11〕：①阴阳失调说；②脏腑虚衰说(包括肾亏虚为主说、脾胃虚衰为主说)；③精气神亏耗说等。在脏腑虚衰说中，认为肾气虚衰是衰老的主要原因，《素问》曰：“五脏之真，惟肾为根”，认为肾阳通过蒸化肾阴产生肾气，而肾气则直接关系到人体的生长、发育、生殖和衰老。可以说，变老与否、变化的速度、寿命的长短，很大程度取决于肾气的强弱，所以肾气虚衰是衰老的重要原因。

肾虚中又以肾阳虚与衰老的关系最为密切。中医学认为，阳气是人体生命活动中的动力源，与寿命关系极大。如《内经》云：“阳气者，若天与日，失其所则折寿而不彰”，“人年五十以上，阳气日衰，损与日至，心力渐退，忘前失后，兴居怠惰”。可见老年人功能退行性改变是阳气衰微的结果。肾阳为人体一身阳气之根本，若肾阳一衰，则一身之阳皆衰，从而加速衰老的进程。可见肾是全身各脏腑的调节中心，肾气虚中的肾阳虚是人体衰老的主要原因。

本研究结果提示灵龟八法对肾阳虚家兔血清IL-2水平具有明显的提高作用，这可能与其刺激细胞毒性T淋巴细胞细胞的增殖和分化有关，从而调节细胞免疫功能。

家兔受羟基脲片免疫抑制后，机体自身调节起免疫应答反应所致产生IgA、IgG、IgM抗体，故数值升高。本研究结果说明灵龟八法艾炷灸可使家兔受羟基脲片免疫抑制减轻，故治疗后IgA、IgG、IgM数值降低，这可能是灵龟八法艾炷灸提高肾阳虚家兔的免疫功能的作用机制之一，这对预防和减缓肾阳虚的进展具有积极的意义。

免疫功能学说是1969年由美国学者R·Walford首先提出的。他认为与自身抗体有关的自身免疫在导致衰老的过程中起着决定性作用。自身免疫的发生，主要是免疫系统自我识别功能的降低或障碍，不能识别“自我”和“非我”，将自身正常的组织细胞，当作外来的“异物”进行攻击，导致机体的损害、衰老和死亡。可见免疫系统对维护人体健康、防止衰老及老年病的防治是很重要的。