彩云木叶化学成分及其抗炎活性研究

阳 航，邹情雅，陈 宇，路艳霞，刘梦元，李路军,3,4*，Paul W.Paré*

1药物高通量筛选国家与地方联合工程研究中心，生物催化与酶工程国家重点实验室，中药生物技术湖北省重点实验室，湖北大学，武汉 430062；2美国德州理工大学 化学与生物化学系，拉伯克 79409；3甘肃百草中药材种植有限公司，兰州 730102；4深圳市老年医学研究所，深圳 518020

彩云木Synadeniumgrantii为大戟科(Euphorbiaceae)聚苞大戟属Synadenium植物，是一种原产于非洲东部多汁灌木，后来作为一种观赏植物引入美洲和欧洲[1]，又称“非洲乳木”。该木树枝折断或剥离茎皮，会产生白色乳胶汁[2]。临床报告指出接触该植物的乳胶汁，脸和脖子产生象火烧一样的刺激感[3]。巴西民间常把该植物乳胶汁作为一种传统药物用于多种疾病的治疗，如过敏，胃肠紊乱[4]，肿瘤[5]等。该植物的叶也具有广泛的药理活性，研究表明彩云木叶乙醇提取物具有明显的镇痛、抗炎[6]，抗菌[7]、抗肿瘤、抗血管生成[8]和改善痛经作用[9]。Hassan等[10]发现其叶的氯仿提取物具有肿瘤细胞毒和抗寄生虫作用，并从中得到两个新的二萜酯类成分。Andersen等[11]从中分离得到多个花色素芹菜糖苷类成分。为了深入研究该植物化学资源，继续寻找具有抗炎活性的化学成分，本研究对其叶的二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取物的化学成分及其体外抗炎活性进行了研究，以探明其抗炎生物活性物质基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

JEOL ECS 400 MHz核磁共振仪(Peabody，MA，USA)；ESI-MS(API2000三重四级杆质谱仪，Applied Biosystems，Foster City，CA)；分析和半制备型HPLC为Agilent 1100 HPLC(DAD检测器)；色谱柱为Zorbax SB-C18(Agilent，4.6 mm × 250 mm×5 μm，1 mL/min；9.4 mm × 250 mm×5 μm，3 mL/min)；紫外分析仪(Spectroline，Westbury，NY，USA)；Buchi R-114旋转蒸发仪；CO2培养箱(德国Heraeus公司)； 超净工作台(中国苏州安泰空气技术有限公司)； XDS-1B型倒置显微镜(中国北京佳源兴业有限公司);硅胶60(0.040～0.063 mm，EMD Millipore，Billerica，MA，USA)；Sephadex LH-20(GE healthcare Bio-sciences AB)；MCI Gel CHP20P；大孔树脂HP-20(日本，三菱)；薄层硅胶板GF 254(Merck KGaA，Darmstadt Germany)，正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇(Fisher Chemical，Certified ACS，Fair Lawn，NJ，USA);其他试剂为分析纯； 二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS)(Sigma 公司)；DMEM培养基购于HyCloneTM公司；胎牛血清(FBS)购于浙江天杭生物科技有限公司；NO检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。

样品原料由埃及国家研究中心Mohamed-Elamir F.Hegazy教授采集并鉴定为SynadeniumgrantiiHook F.的干燥叶，标本(编号20161201)存放于美国德州理工大学化学与生物化学系Paul W.Paré教授实验室。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7由药物高通量筛选国家与地方联合工程研究中心提供。

1.2 提取与分离

干燥的彩云木叶(900 g)，适当粉碎，用3 L CH2Cl2-MeOH(1∶1，V/V)混合液室温浸渍提取3次，合并提取液减压浓缩除去溶剂，得提取浸膏63.5 g。取上述浸膏46.9 g 经硅胶柱色谱(0.040～0.063 mm)分离，以正己烷-乙酸乙酯系统梯度洗脱(100∶1→1∶100)，得62个流分F1～F62。取流分F15经硅胶柱色谱，正己烷-乙酸乙酯(6∶1)洗脱后再经Sephadex LH-20柱用CH2Cl2-MeOH(1∶1)洗脱得化合物1(20.0 mg)，流分F19经硅胶柱色谱由正己烷-乙酸乙酯(20∶1→4∶1)洗脱得化合物2(10.2 mg)。流分F26经硅胶柱色谱/正己烷-乙酸乙酯(4∶1)得化合物3(3.6 mg)，流分F30经硅胶柱色谱用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)洗脱后得3个主要次级流分F26a-F26c，F26a经重结晶得化合物4(50.0 mg)，F26c再经硅胶柱色谱/正己烷-乙酸乙酯(10∶1)得化合物5(40.1 mg)；流分F38上Sephadex LH-20柱经CH2Cl2-MeOH(1∶1)洗脱得2个主要次级流分F38a和F38b， F38a经RP-HPLC/乙腈-水(4∶1→9∶1)梯度洗脱得化合物6(15.3 mg)。流分F60经硅胶柱由CH2Cl2-MeOH-H2O(200∶10∶1)洗脱得3个次级流分F60a～F60c，F60a经再硅胶柱分离得化合物8(30.6 mg)，F60c经Sephadex LH-20柱MeOH洗脱得化合物7(8 mg)。流分F62用大孔吸附树脂依次用纯水、50%和95%乙醇水溶液洗脱，取50%乙醇洗脱液经硅胶柱由CH2Cl2-MeOH(20∶1→5∶1)梯度洗脱得4个次级流分F62a～F62d，F62a经RP-HPLC用MeOH-H2O梯度洗脱得化合物9(9.4 mg)，F62d经Sephadex LH-20柱以MeOH洗脱得化合物10(7.0 mg)。

1.3 体外细胞毒和抗炎活性筛选实验

1.3.1 细胞毒实验

取对数生长期RAW264.7小鼠巨噬细胞按1×105个/mL， 200 μL/孔接种于96孔板中， 用含10% FBS 的 DMEM 培养基于37 °C、5% CO2培养箱中培养24 h后弃培养基，分别加入不同浓度的部分单体化合物至0、3.125、6.25、12.5、25、50 μM继续培养24 h，每组设3个复孔，MTT法测定细胞存活率。

1.3.2 抗炎活性筛选

取单体化合物分别用DMSO配制成50 μM的溶液作为储备液，加药时用无血清培养基稀释。同样条件培养细胞24 h后弃培养基，加入100 μL浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μM的系列单体化合物溶液孵育4 h，每组设3个复孔，加入终质量浓度为1 μg/mL的LPS刺激细胞继续培养20 h。离心， 取上清液，移至新的96孔板，按照试剂盒说明书规定的方法，在540 nm波长下用酶标仪测定NO，计算最大半数抑制浓度(IC50)值。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色针晶(正己烷-乙酸乙酯)；mp.179～181 ℃，ESI-MS：m/z465 [M+K]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.75(3H，s，H-23)，0.83(3H，s，H-25)，0.89(3H，s，H-24)，0.93(6H，s，H-26，27)，0.94(3H，s，H-28)，1.03(3H，s，H-29)，1.08(3H，s，H-30)，3.46(1H，dd，J= 5.6，11.0 Hz，H-3)，4.86(1H，s，H-19)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：142.9(C-18)，129.8(C-19)，76.4(C-3)，51.1(C-5)，49.3(C-9)，43.5(C-14)，41.1(C-8)，38.9(C-4，13)，38.5(C-1)，37.8(C-16)，37.7(C-22)，37.5(C-10)，34.6(C-7)，34.5(C-17)，33.5(C-21)，32.3(C-20)，31.5(C-29)，29.3(C-30)，28.4(C-23)，27.6(C-15)，26.4(C-12)，25.6(C-2)，25.4(C-28)，22.3(C-26)，21.1(C-11)，18.4(C-6)，16.7(C-25)，16.2(C-24)，14.8(C-27)。以上数据与文献[12]基本一致，故化合物1鉴定为日尔曼醇。

化合物2白色针晶(正己烷-乙酸乙酯)；mp.116～118 ℃，ESI-MS：m/z465 [M+K]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.76(3H，s，H-18)，0.79(3H，s，H-29)，0.86(3H，s，H-30)，0.89(3H，d，J= 6.4 Hz，H-2l)，0.96(3H，s，H-28)，1.00(3H，s，H-19)，1.60(3H，s，H-26)，1.68(3H，s，H-27)，3.24(1H，dd，J= l1.8，4.6 Hz，H-3)，5.10(1H，t，J= 7.0 Hz，H-24)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：134.2(C-9)，133.7(C-8)，131.1(C-25)，125.4(C-24)，79.2(C-3)，51.1(C-17)，50.2(C-5)，50.1(C-14)，44.2(C-13)，39.1(C-4)，37.4(C-20)，36.6(C-10)，36.5(C-1)，35.4(C-22 )，31.2(C-16)，30.9(C-15)，28.2(C-12)，28.1(C-29)，27.8(C-7)，26.6(C-28)，25.9(C-27)，25.1(C-23)，24.5(C-2)，21.6(C-11)，20.3(C-19)，19.1(C-21)，18.8(C-6)，17.8(C-26)，15.7(C-18)，15.6(C-30)。以上数据与文献[13]基本一致，故化合物2鉴定为大戟醇。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z392 [M-H2O]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.88(3H，t，J= 6.5 Hz，H-28)，1.26(-CH2)，3.65(2H，q，J= 6.6 Hz，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：63.3(C-1)，33.0，32.1，29.9，29.8，29.6，29.5，25.9，22.9(多个亚甲基C信号)，14.3(C-28)。以上数据与文献[14]基本一致，故化合物3鉴定为正二十八烷醇。

化合物4无色针晶(正己烷-乙酸乙酯)；mp.136～138 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，d，J= 5.2 Hz，H-6)，3.52(1H，m，H-3α)，1.00(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，0.84(3H，t，J= 7.6 Hz，H-29)，0.83(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 6.9 Hz，H-27)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：140.9(C-5)，121.8(C-6)，71.9(C-3)，56.9(C-14)，56.2(C-17)，50.2(C-9)，45.9(C-24)，42.4(C-4)，42.4(C-13)，39.9(C-12)，37.4(C-1)，36.6(C-10)，36.2(C-20)，34.0(C-22)，32.0(C-7)，32.0(C-8)，31.7(C-2)，29.3(C-25)，28.3(C-16)，26.2(C-23)，24.4(C-15)，23.2(C-28)，21.2(C-11)，19.9(C-27)，19.5(C-19)，19.1(C-21)，18.9(C-26)，12.1(C-29)，11.9(C-18)。以上数据与文献[15]基本一致，故化合物4鉴定为β-谷甾醇。

化合物5白色针晶(乙酸乙酯)；mp.165～167 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.36(1H，br.d，J= 5.0 Hz，H-6)，3.55(1H，m，H-3)，0.69(3H，s，CH3-18)，0.83(3H，s，CH3-19)，0.91(3H，d，J= 6.0 Hz，H-21)，5.13(1H，dd，J= 8.0，15.1 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J= 8.0，15.1 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J= 6.3 Hz，CH3-26)，0.79(3H，d，J= 5.5 Hz，CH3-27)，0.81(3H，t，J= 7.4 Hz，CH3-29)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：141.0(C-5)，138.5(C-22)，129.6(C-23)，121.9(C-6)，72.1(C-3)，57.1(C-14)，50.4(C-9)，57.0(C-17)，51.5(C-24)，42.6(C-13)，42.5(C-20)，40.6(C-4)，40.0(C-12)，37.5(C-1)，36.8(C-10)，32.2(C-7)，32.2(C-8)，32.0(C-2)，31.9(C-25)，29.1(C-16)，25.6(C-28)，24.6(C-15)，21.4(C-27)，21.2(C-11)，20.2(C-21)，19.6(C-19)，19.2(C-26)，12.5(C-29)，12.3(C-18)。以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物5为豆甾醇。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z611 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.76(1H，dd，J= 15.0，9.0 Hz，H-1′)，1.67(1H，d，J= 15.0 Hz，H-1′)，2.50(1H，m，H-2)，5.14(1H，d，J= 8.6 Hz，H-3)，5.39(1H，br s，H-5)，5.14(1H，br s，H-7)，4.52(1H，dd，J= 1.9，10.7 Hz，H-8)，1.09(1H，dd，J= 9.0，10.9 Hz，H-9)，1.02(1H，dd，J= 9.0，10.9 Hz，H-11)，4.81(1H，dd，J= 3.4，10.9 Hz，H-12)，2.86(1H，qd，J= 3.8，7.1 Hz，H-13)，0.91(3H，d，J= 7.5 Hz，H-16)，2.06(3H，dJ= 1.2 Hz，H-7)，1.04(3H，s，H-18)，0.81(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J= 7.1 Hz，H-20)，1.96，2.06，2.09(各 3H，s，3 × CH3COO)，3.70(2H，br s，H-7′)，7.26～7.33(5H，m，H-2′，6′，3′，5′，4′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：207.7(C-14)，170.5，170.8，170.4(3×CH3CO)，170.3(C-8′)，139.4(C-6)，133.8(C-1′)，129.3(C-3′，5′)，128.6(C-2′，6′)，127.2(C-4′)，117.3(C-5)，77.0(C-7)，76.9(C-3)，73.4(C-4)，71.6(C-8)，71.2(C-15)，71.1(C-16)，70.7(C-12)，43.1(C-13)，41.5(C-7′)，31.5(C-1)，29.8(C-2)，29.6(C-11)，29.2(C-18)，24.7(C-9)，20.7，21.0，21.1(3 × CH3CO)，19.4(C-10)，17.6(C-17)，16.2(C-19)，13.5(C-20)。以上数据与文献[17]基本一致，故化合物6鉴定为Ingol 7，8，12-triacetate 3-phenylacetate。

化合物7黄色粉末；ESI-MSm/z：455 [M+Na]+，1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：0.90(3H，d，J= 5.8 Hz，H-6″)，3.86(1H，m，H-2″)，3.69(1H，m，H-3″)，3.30(2H，m，H-4″，5″)，5.54(1H，d，J= 1.2 Hz，H-1″)，6.27(1H，br s，H-6)，6.47(1H，br s，H-8)，6.91(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3′，5′)，7.80(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2′，6′)，12.72(1H，s，5-OH)，4.20，3.86(各 1H，br s，7，4′-OH);13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：179.3(C-4)，164.9(C-7)，163.2(C-5)，161.0(C-4′)，158.4(C-2)，158.0(C-9)，135.7(C-3)，131.7(C-2′，6′)，122.5(C-1′)，116.3(C-3′，5′)，105.8(C-10)，102.6(C-1″)，99.5(C-6)，94.5(C-8)，72.9(C-4″)，72.1(C-2″)，71.5(C-3″)，71.3(C-5″)，17.8(C-6″)。以上数据与文献[18]基本一致，故化合物7鉴定为山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化合物8白色粉末(氯仿-甲醇)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：5.33(1H，s，H-6)，4.42(1H，t，J= 5.8 Hz，H-3)，4.22(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，0.65(3H，s，CH3-18)，0.95(3H，s，CH3-19)，0.90(3H，d,J= 6.5 Hz，CH3-21)，0.83(3H，t，J= 6.2 Hz，H-29)，0.81(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.79(3H，d，J= 6.9 Hz，H-27);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：141.3(C-5)，122.3(C-6)，100.8(C-1′)，79.0(C-3)，56.2(C-14)，55.4(C-17)，49.6(C-9)，45.1(C-24)，41.9(C-13)，39.3(C-4)，38.2(C-12)，36.8(C-1)，36.2(C-10)，35.5(C-20)，33.4(C-22)，31.5(C-8)，31.4(C-7)，29.3(C-2)，28.7(C-25)，27.8(C-16)，25.4(C-23)，23.9(C-15)，22.6(C-28)，20.6(C-11)，19.8(C-27)，19.1(C-26)，18.9(C-19)，18.6(C-21)，11.8(C-29)，11.7(C-18)，73.5(C-2′)，76.9(C-3′)，70.1(C-4′)，76.8(C-5′)，61.1(C-6′)。以上数据与文献[19]基本一致，故化合物8鉴定为胡萝卜苷。

化合物9白色粉末(甲醇)；mp.266～267 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.85(1H，s，H-5′)，7.66(1H，s，H-5)，5.48(1H，d，J= 8.4 Hz，H-1′′)，5.17(1H，d，J= 8.4 Hz，2′′-OH)，5.08(1H，d，J= 5.3 Hz，4′′-OH)，4.58(1H，t，J= 5.3 Hz，3′′-OH)，4.10(3H，s，3-OCH3)，4.05(3H，s，3′-OCH3)，4.01(3H，s，4-OCH3)，3.70(1H，m，H-2′′)，3.52(1H，m，H-3′′)，3.36(2H，m，H-4′′，5′′)，3.24(2H，m，H-6′′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：158.5(C-7′)，158.2(C-7)，154.4(C-4′)，151.9(C-4)，141.9(C-2′)，141.3(C-3′)，141.2(C-2)，140.9(C-3)，113.7(C-6′)，112.9(C-1′)，112.7(C-6)，112.4(C-1)，112.1(C-5)，107.6(C-5′)，101.3(C-1′′)，77.3(C-3′′)，76.5(C-5′′)，73.3(C-2′′)，69.5(C-4′′)，61.7(3′-OCH3)，61.4(3-OCH3)，60.5(C-6′′)，56.8(4-OCH3)。以上数据与文献[20]基本一致，故化合物9鉴定为3，4，3′-三甲氧基鞣花酸-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10黄色粉末；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.06(2H，d，J= 8.9 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J= 8.9 Hz，H-1′，5′)，6.41(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.26(2H，d，J= 7.5 Hz，H-1″)，3.69(1H，dd，J= 2.3，11.9 Hz，Hα-6″)，3.53(1H，dd，J= 5.4，11.9 Hz，Hβ-6″)，3.43(2H，m，H-2″，5″)，3.19(2H，m，H-3″，4″)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：179.5(C-4)，166.2(C-7)，163.1(C-5)，161.6(C-4′)，159.1(C-2)，158.6(C-9)，135.4(C-3)，132.3(C-2′，6′)，122.8(C-1′)，116.1(C-3′，5′)，105.7(C-10)，104.0(C-1″)，99.9(C-6)，94.8(C-8)，78.5(C-5″)，78.1(C-3″)，75.7(C-2″)，71.4(C-4″)，62.6(C-6″)。以上数据与文献[21]基本一致，故化合物10鉴定为山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 部分化合物细胞毒和抗炎活性

部分化合物细胞毒性和抗炎活性结果如表1所示，化合物1、2、6、7、9和10在50 μM浓度下对细胞没有明显毒性。化合物9抑制LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的IC50值为 12.0±0.9 μM， 显示出了较强的抑制活性。化合物1、2、7和10的IC50值分别为28.0±1.6、30.8±2.0、38.4±2.1和33.5±1.7 μM，化合物6的IC50值大于50 μM。

表1 部分化合物的细胞毒性和抗炎活性Table 1 Cytotoxicity and anti-inflammatory activity of some compounds

3 结论与讨论

本研究对彩云木的二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取物的化学成分及其体外抗炎活性进行了研究，从中分离鉴定了10个化合物，化合物类型主要包括三萜(2个)、Ingol烷型二萜(1个)、黄酮苷类(2个)、甾醇及其苷类(3个)、多酚类(1个)和脂肪醇(1个)。其中化合物3、6～10为首次从该种植物中分离得到，化合物3、6、8和9为首次从聚苞大戟属植物中分离得到。

以脂多糖(LPS)诱导 RAW264.7细胞为体外炎症模型，通过抑制一氧化氮(NO)生成实验评价部分化合物抗炎活性，其中1、2、7和10具有较弱的抗炎活性，多酚类化合物9显示出较好的抗炎活性，有潜力成为治疗炎症性相关疾病的新型药物资源。该研究丰富了彩云木叶的化学成分，解析其抗炎活性物质基础，为其药物研发及利用提供了科学依据。

致谢：感谢埃及国家研究中心植物化学系Mohamed-Elamir F.Hegazy教授提供的植物原料及药材提取工作。