人精液内蛋白激酶A、精子透明质酸酶与男性不育关系的研究

戴研平 高晓勤 倪佳

1.贵州医科大学基础医学院，贵州 贵阳 550004；2.遵义医药高等专科学校基础医学院，贵州 遵义563006；3.岳阳市岳阳楼区人民医院，湖南 岳阳 414000；4.洛阳市人民医院，河南 洛阳 471000

蛋白激酶A（PKA）是细胞信号转导的关键分子，在各种组织中高表达，PKA 是被发现的第一个蛋白激酶［1］，PKA 还参与调节精子的获能和顶体反应，与男性不育密切相关［2］。精子顶体内透明质酸酶（HYD）在受精过程中的精卵识别、结合阶段所起到至关重要的作用［3］。本课题组前期研究结果发现精子透明质酸酶活性强度及阳性反应率与精液参数存在显著相关性［4］。大量研究表明，顶体是特殊的溶酶体，内含有顶体酶、透明质酸酶等，均参与受精过程。目前蛋白激酶与男性不育的关系越来越引起人们的重视。但有关蛋白激酶A 与透明质酸酶相关性的报道较少见。本研究测定人精液PKA 含量对精子HYD 阳性率的影响，为男性不育的诊断和治疗提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2016～2017 年贵州医科大学附属医院生殖医学中心门诊健康中青年男性自愿献精者17 例（已正常生育1 个或2 个子女）作为正常生育组，年龄20～40 岁。选择同期生殖中心门诊的不育患者36例作为不育组，年龄20～40 岁。依据WHO 推荐的不育诊断标准，即女方妇产科检查正常，婚后1 年正常性生活不育、精液常规检查中精子的数量少于20×106/mL男性不育患者，无家族遗传病史，无外伤，无严重躯体性疾病；排除隐睾症、腮腺炎、内分泌系统疾病等［5］。根据精液常规检查分析结果，将不育组划分为三组：不明原因不育组（9 例）、少精或畸形精子多组（15 例）、泌尿生殖系统炎症组（12 例）。

1.2 仪器与试剂 伟力WLJY9000 彩色精子质量检测系统（北京中科恒业有限公司）；9905014 型轮转式切片机（上海 Leica 仪器有限公司）；Sartorius BS2103 电子天平（德国Sartorius 公司）；高速冷冻离心机（sigma公司）；PX-150C 型恒温恒湿箱（天津实验仪器厂）；酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）；PKA 检测试剂盒（南京生物建成有限公司），改良透明质酸钠—明胶底物膜（自制）。

1.3 方法

1.3.1 标本收集。所有研究对象均禁欲3～7 天，用新洁尔灭消毒手及尿道口，以手淫法获取1 次全部精液，置入37℃恒温恒湿箱中30min 待其液化，采用伟力彩色精子质量检测系统做精液常规分析，并获得精子活力值。

1.3.2 酶联免疫吸附测试（定量）人精液PKA 含量。精液PKA 含量的测定，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 改良透明质酸钠—明胶底物膜法测HYD 阳性率。选用本课题组改良透明质酸钠—明胶底物膜法制作底物膜，采集的新鲜精液室温30min 液化后，2400r/min 离心 10min，共 2 次，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗，5min，共2 次。沉淀物悬浮于2 倍以上磷酸盐缓冲液（PBS）中，分双份备用。将上述PBS 精子悬浮液1、2滴涂于药盒底膜片，37℃恒温恒湿箱孵育，3h 后取出，室温下干燥，于普通光镜下观察孵育结果并染色。

1.4 观察指标 终止孵育后，每组随机观察5 张切片，每张切片选择5 个视野，以精子头部周围出现晕环者为阳性，并用微尺测量视野下每个精子头部晕环直径的大小，取其平均值作为判断HYD 活性强度的指标。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件进行分析，以均数±标准差（）表示，组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD 检验，采用相关分析分析相关性。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HYD 阳性率 光镜下检测，正常生育组HYD 反应平均阳性率为80.74%，最高阳性率达92.45%；不明原因不育组的HYD 反应平均阳性率为50.32%，最高达90.86%；少精或精子畸形数多组的HYD 反应平均阳性率为24.64%，最高达49.62%；曾患过泌尿生殖系统炎症组的HYD 反应平均阳性率为33.04%，最高达84.78%。见图1。

图1 各组HYD 阳性率检测结果（LM 10×40）

2.2 各组中PKA 含量与HYD 阳性率 与正常生育组比较，不明原因不育组、少精或畸形精子多组、泌尿生殖系统炎症组精子PKA 含量与HYD 阳性率均下降（P＜0.05）。与不明原因不育组比较，少精或畸形精子多组、泌尿生殖系统炎症组精子PKA 含量与HYD 阳性率下降（P＜0.05）。其余各组间比较均无统计意义（P＞0.05）。见表 1。

2.3 精子PKA 含量与HYD 阳性率的相关性分析 生育组及不育各组中精子PKA 含量与HYD 阳性率的相关图（散点图）如下。精子PKA 含量与HYD 阳性率呈显著正相关（r=0.873，P＜0.01）。见图 2。

表 1 各组中 PKA 含量与 HYD 阳性率（）

表 1 各组中 PKA 含量与 HYD 阳性率（）

注：与正常生育组比较：aP＜0.01，与不明原因组比较：bP＜0.05

组别 n PKA 含量（ng/mL） HYD 阳性率（%）正常生育组 17 664.76±83.63 80.74±18.3不明原因不育组 9 511.33±56.93a 50.32±13.1a少精或畸形精子多组 15 459.27±30.74ab 24.64±10.1ab泌尿生殖系统炎症组 12 472.17±25.37ab 33.04±11.6ab

3 讨论

图2 精子PKA 含量与HYD 阳性率的相关图（散点图）

生殖细胞内酶学检查是判断男性生育力强弱的一个重要指标。透明质酸酶是一种以降解透明质酸为主的糖苷酶，关于透明质酸酶及其相关的研究越来越引起人们的重视［6］。吴军等［7］发现精液透明质酸酶活性降低和磷脂酶A2 含量缺乏可能是引起男性不育的病因之一。本课题组前期研究结果表明，精液中NO 含量、精子顶体内透明质酸酶、精浆中α-1，4 糖苷酶、人精子内顶体蛋白酶、双羰基/L－木酮糖还原酶（DCXR）均可能是引起男性不育的重要因素［8-12］。本课题组前期研究还发现精液沙眼衣原体（CT）感染能够使精液中NO 含量升高和精子顶体内HYD 活性下降，影响男性生育力［13］。

本研究结果显示，与正常生育组比较，不育各组中的精子PKA 含量和精子HYD 阳性率均较低。与不明原因组比较，少精或畸形精子多组精子PKA 含量均较低。不育组中的PKA 含量的减少是导致精子HYD 阳性率减弱可能是导致男性不育的重要原因之一。本实验表明了精子PKA 含量与精子HYD 阳性率呈显著正相关，也间接说明PKA 的含量与顶体反应有相关性，而顶体是精子头部的重要组成部分，顶体发生异常最终会导致男性的生育能力下降［14］。

总之，受精是一个复杂和多因素参与的过程，精液中PKA 含量可能通过影响精子活力、顶体酶活性和HYD 阳性率，从而影响受精能力，进而导致男性不育，但其具体机制有待进一步研究。