乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平与TLR2 表达的相关性

邰小凤

天水市第一人民医院，甘肃 天水 741000

乙肝肝硬化为一种慢性进行性肝病，由乙肝长期反复作用形成的临床疾病。乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝性DNA 病毒，可通过接触被感染者的体液、血液进行传播，从而引起乙肝肝硬化。该病在发病早期无明显的临床症状，20%左右的患者可进展为肝衰竭、肝癌等，严重情况下可导致患者死亡［1］。乙肝肝硬化在病理上可表现为纤维结缔组织增生、肝细胞损伤、肝细胞再生、肝变形坏死等，其发病除了与HBV 有关外，也与遗传、自身抗原、免疫紊乱等多种因素相关［2］。研究发现乙肝肝硬化患者的肝组织和外周血中存在大量的自身反应性淋巴细胞，从而促进该病的炎症反应过程［3］。Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）是近年来发现的在获得性免疫系统、天然免疫中都发挥重要作用的模式识别受体家族，也是能够识别病原微生物表达的保守结构基因序列。TLRs 可以启动细胞因子的释放，激发机体对病原体的免疫反应，特别是TLR2 可以识别多种病原微生物，包括支原体、螺旋体、革兰氏阳性菌等，从而导致机体产生不同的抗细菌、抗病毒免疫反应［4］。本文探讨了乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平与TLR2 表达的相关性，希望为乙肝肝硬化发病机制的研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018 年2 月到2020 年3 月天水市第一人民医院诊治的乙肝患者320 例作为研究对象，根据肝硬化情况分为观察组（合并肝硬化，n=120）与对照组（无合并肝硬化，n=200），两组患者的病程、体重指数、性别、年龄、Child-Pugh 分级、收缩压、舒张压等对比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。本研究经医院伦理委员会批准实施，患者签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合慢性乙肝的诊断标准［5］；HBV-DNA 检测阳性；年龄 20～80 岁；临床资料完整。排除标准：近3 个月使用过免疫抑制剂的患者、妊娠与哺乳期妇女、合并艾滋病、肿瘤等患者、自身免疫性肝病、遗传代谢因素引起的肝病。

1.3 HBV-DNA 检测 采集患者空腹静脉血，3000r/min离心6min，取上层血清液，采用实时免疫荧光PCR 检测血清HBV-DNA 含量（以Log 数计量）。同时采用全自动生化分析仪测定血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALP）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）。

1.4 TLR2 检测 取空腹静脉血，1500rpm 室温离心10min，吸取上清至距离红细胞层约1～2cm 区域白层，分装至冻存管中。采用密度梯度离心法分离单个核细胞，使用流式细胞术检测单核细胞表面TLR2 表达水平，以平均免疫荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示 TLR2 表达强度。

1.5 观察指标 （1）对比两组的HBV-DNA 表达水平；（2）对比两组的 TLR2 表达水平；（3）分析乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平与TLR2 表达的相关性；（4）分析乙肝肝硬化患者TLR2 表达的影响因素。

1.6 统计方法 采用SPSS 21.0 软件，计量资料以均数±标准差表示（呈正态分布，对比方法为t 检验），计数数据用率表示（对比方法为卡方检验），相关性分析采用多重线性回归分析与Pearson 相关分析，P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 对比两组HBV-DNA 表达水平 观察组的血清HBV-DNA 含量高于对照组，血清 TBiL、DBiL、ALP、GGT值明显高于对照组（P＜0.05）。见表2。

2.2 TLR2 表达水平对比 观察组 TLR2 水平为（178.29±22.18），对照组为（79.92±12.77），观察组单个核细胞的TLR2 表达水平显著高于对照组（t=44.371，P＜0.001）。

表1 两组一般资料对比

表2 两组HBV-DNA 表达水平（）

表2 两组HBV-DNA 表达水平（）

组别nHBV-DNA（Log）TBi（μmol/L）DBi（μmol/L）ALP（U/L）GGT（U/L）观察组 120 6.56±0.89 35.54±3.43 24.31±3.52 750.21±10.34 482.33±12.46对照组 200 5.61±0.98 27.42±2.89 18.66±3.44 560.41±14.24 296.54±13.62 t 8.685 22.662 14.085 127.231 121.93 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 相关性分析 Pearson 分析显示，HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平与 TLR2 表达呈正相关（P＜0.05）。以 HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平作为自变量，以TLR2 表达作为因变量，多重线性回归分析显示 HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平为影响 TLR2表达的主要影响因素（P＜0.05）。见表3、表4。

表3 乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平与TLR2 表达的相关性

3 讨论

HBV 是一种嗜肝DNA 病毒，不同人群感染HBVDNA 后可呈现不同的预后。80%人群感染后体内的病毒很快被清除，而20%人群则不能有效清除感染病毒而发展成慢性感染，其中有20%左右发展成肝硬化。乙肝肝硬化是乙肝发展的后期阶段，以再生结节形成、弥漫性肝纤维化、假小叶为特征，导致肝脏储备功能严重受损，严重情况下可进展为肝衰竭与肝癌［6］。本研究显示，观察组的血清HBV-DNA 含量高于对照组，血清 TBiL、DBiL、ALP、GGT 值明显高于对照组，表明乙肝肝硬化患者除了肝功能严重受损外，也伴随有HBVDNA 的高表达。从机制上分析，HBV-DNA 的大量复制易造成肝纤维结缔组织增生，肝细胞再生结节变多，细胞外基质沉积，伴随有肝小叶结构受损，从而可进展为肝纤维化与肝硬化，同时TBiL、DBiL、ALP、GGT上升，表明患者肝脏储备功能下降，肝细胞受损严重，也容易发生肝硬化。

表4 影响乙肝肝硬化患者TLR2 表达的影响因素

乙肝患者体内HBV 不断复制，通过机体的免疫机制，造成纤维结缔组织增生与肝细胞再生，最终进展为肝硬化。TLR2 是与病毒感染关系较为密切的一种模式识别受体，TLR2 激活可以导致机体产生不同的免疫反应机制，其在结构上分为胞外段、跨膜段和胞内段，特别是胞外段富含亮氨酸重复序列的N 端，可识别病原体细胞表面的分子标志。胞内区负责TLR2 下游信号转导，可调节获得性免疫、固有免疫作用。有研究显示，HBV-DNA 可与人巨噬细胞的硫酸乙酰肝素成分结合后，从而激活TLR2 信号通路；另外机体的内源性配体等也可激活TLR2，促进炎症细胞因子的分泌，从而引起肝损伤［7］。本研究显示观察组单个核细胞的TLR2表达水平显著高于对照组。表明HBV-DNA 大量复制可上调TLR2 的功能性表达，从而增加相关炎症和细胞因子的表达，改变机体免疫反应，从而诱导机体发生肝硬化。

本研究Pearson 分析显示乙肝肝硬化患者的HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平与 TLR2 表达呈正相关，主要是由于乙肝患者血清HBV-DNA 水平反映了病毒在肝脏内的复制程度，其复制过程中引发了机体免疫病理反应，也会激发机体免疫系统对乙肝病毒的清除，从而导致肝细胞损伤、破坏与肝脏组织纤维化，导致机体出现肝脏炎症及损伤修复反应，也会诱发TLR2 的大量表达。

多重线性回归分析显示，HBV-DNA、TBiL、DBiL、ALP、GGT 水平为影响TLR2 表达的主要影响因素，表明乙肝肝硬化患者HBV-DNA 水平与TLR2 表达存在显著相关性。从机制上分析，HBV-DNA 大量复制可促进TLR2 激活，影响抗原呈递细胞功能，帮助病毒逃逸机体的免疫监视，激活炎症因子的表达，导致免疫紊乱，造成肝细胞损伤的发生。并且TLR2 过量表达可激活肝星状细胞和库普弗细胞表达，启动半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，刺激巨噬细胞产生转化生长因子β，可导致肝细胞的凋亡或死亡。也有研究表明，表达TLR2 的细胞如果发生凋亡，可降低过度的免疫应答，可保障调控免疫应答在适度的水平，从而有利于改善乙肝患者的预后［8］。本研究也存在一定的不足，TLR 存在多个亚型分子，没有对TLR4、TLR6 等进行分析，且没有进行远期随访，将在后续研究中深入探讨。

总之，乙肝肝硬化患者伴随有HBV-DNA 的大量复制与TLR2 的高表达，两者存在正相关性，检测HBVDNA、TLR2 表达水平对指导乙肝肝硬化患者诊疗有重要临床价值。