黄金抹茶碱液浸泡蒸青护绿工艺优化及品质研究

鲁 颖谭永生姚茂君杨 茜孙 雯

(1. 吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2. 吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000；3. 湘西自治州质量检验及计量检定中心，湖南 吉首 416000)

黄金茶是湘西特有的珍稀地方茶树品种资源[1]，其氨基酸含量和水浸出物含量分别为7.47%，41.04%，高出同期其他绿茶，而茶多酚含量仅为18.04%[2]，高浸出物和低酚氨比的优异特性使得黄金茶成为生产抹茶的优质原料[3]。色泽是评判抹茶品质等级的重要因素，翠绿的色泽是高品质抹茶所必须具备的[4-5]。但在抹茶加工过程中，叶绿素易受光、热、pH等外界因素的影响而发生褪色或变色[6]，显著影响抹茶品质。

目前，国内外学者对果蔬护绿进行了大量研究，而对茶叶的护绿工艺却鲜见报道。果蔬加工中常将物理漂烫作为控制酶促褐变的预处理方法，以保证产品具备良好的色泽和感观[7-9]。而抹茶通常使用物理蒸青来钝化酶的活性，其主要是利用蒸汽穿透叶层，使叶温迅速升高，从而达到加速叶中酶钝化的效果，最大程度地减少叶绿素等内含成分的损失[10-11]。常用的化学护绿方法主要有碱液浸泡、各类护绿剂(如抗坏血酸、金属离子化合物、叶绿素铜钠盐等)处理等[12-14]。铜、锌等金属离子处理方法受元素残留等食品安全性问题的影响，使用受到限制[15]；叶绿素铜钠盐等护绿剂染色法成本较高，在实际应用中较少使用[16]。而碱液处理可使叶绿素发生水解皂化反应，生成绿色叶绿素钠盐[17]，且能除去黄金茶表面的蜡膜利于护绿剂的渗透，达到良好的护绿效果[18]。该方法护绿效果明显、操作简单易行、无食品安全性问题，因此被广泛应用于果蔬的护绿工艺中。研究拟以黄金茶为原料，结合蒸汽杀青和碱液浸泡的护绿方式研制色泽翠绿的高品质黄金抹茶。利用Plackett-Burman(PB)试验筛选出显著因素[19]，通过最陡爬坡试验和Box-Behnken试验确定最佳护绿工艺，并对黄金抹茶进行品质研究，以期为黄金茶开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄金茶叶：湘西汇丰农业有限公司；

无水乙醇、丙酮：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

碳酸钙、无水碳酸氢钠：分析纯，麦克林试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见—分光光度计：UV-2450型，日本岛津公司；

电子天平：FA224型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

鼓风干燥箱：GZX-9246MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

高速中药粉碎机：ZN-400A型，上海元析仪器有限公司；

行星式球磨机：KQM-X4型，咸阳金宏通用机械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 碱液浸泡蒸青护绿法制备黄金抹茶 统一人工采摘经过遮阴覆盖的一芽两叶黄金茶，选择大小均一，色泽均匀，成熟度一致，无伤、无病虫害的茶叶，经无水碳酸氢钠溶液浸泡后迅速用流动水冲洗，备用。放入蒸汽器具隔板中进行蒸青处理，保持蒸青器具温度和锅内压力一致，以控制所有批次的蒸汽量一致。蒸青后取出，置于鼓风干燥箱中烘干(80 ℃)，直至恒重。最后将烘干后的茶叶置于高速中药粉碎机进行粗粉碎，再用行星式球磨机进行超微粉碎。

1.2.2 黄金抹茶碱液浸泡蒸青护绿的工艺优化

(1) Plackett-Burman试验：利用Plackett-Burman试验考察碱液质量百分浓度、料液比、蒸青叶层厚度、碱液浸泡时间、蒸青时间5个因素对黄金抹茶叶绿素含量的影响，筛选出具有显著影响的关键因素。每个因素取高(+1)、低(-1) 2个水平。

(2) 最陡爬坡试验：根据Plackett-Burman试验得到的一次拟合方程，设计各关键因素爬坡方向和步长，使得具有显著影响的关键因素取值逼近最大响应区域，确定各重要因素最佳中心点[20]。

(3) 响应面优化试验：根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验的结果，对筛选出的显著性关键因素进行响应面(Box-Behnken)设计，对试验结果建立自变量数学模型，并根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图。

1.2.3 不同加工方式对比 采用同一批鲜叶原料，经3种不同加工处理后，比较得到的黄金抹茶叶绿素、茶多酚、茶氨酸、酚氨比、水浸出物含量及感观评价。

(1) 传统蒸青(方式A)：参照1.2.1的方法，但不对采摘后的黄金茶鲜叶进行碱液浸泡和护绿剂处理，直接采用蒸汽杀青，干燥后超微粉碎得到黄金抹茶。

(2) 滚筒杀青(方式B)：设置杀青温度145 ℃，时间2.5 min，将杀青叶干燥粉碎得到黄金抹茶。

(3) 碱液浸泡蒸青(方式C)：用经响应面优化后得到的最优工艺制备黄金抹茶。

1.2.4 指标测定

(1) 叶绿素含量：参照肖润林等[21]的方法，稍作修改。用V丙酮∶V无不乙醇∶V蒸馏水=4.5∶4.5∶1.0的丙酮—无水乙醇—蒸馏水混合液提取黄金抹茶叶绿素，分别在645 nm和663 nm 处测定吸光度值，按式(1)和式(2)计算叶绿素含量。

c=(12.70×A663 nm-2.69×A645 nm)+(22.90×A645 nm-4.68×A663 nm)，

(1)

(2)

式中：

A663 nm——提取液在663 nm处的吸光度值；

A645 nm——提取液在645 nm处的吸光度值；

ω——叶绿素含量，mg/g；

c——叶绿素浓度，mg/mL；

v——提取液体积，mL；

m——样品鲜重，g。

(2) 茶多酚含量：参照GB/T 8313—2018，以没食子酸为标准品，绘制标准曲线(Y=0.074 8+0.009 2X，R2=0.998 4)，先准确吸取测试液各1.0 mL，再加入5.0 mL 的福林酚试剂，摇匀。待反应3～8 min后，加入4.0 mL 7.5% 碳酸钠溶液，加水定容至25 mL。室温下放置60 min 后在765 nm条件下用分光光度计测定其吸光度，根据标准曲线方程计算茶多酚含量。

(3) 游离氨基酸含量：参照GB/T 8314—2013，以谷氨酸为标准品，绘制标准曲线(Y=-0.259 6+2.651X，R2=0.999 1)，在比色皿中分别吸取1.0 mL测试液、0.5 mL pH 8.0磷酸盐缓冲液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴中加热15 min，待冷却后加水定容至25 mL，在570 nm处测定吸光度，根据标准曲线方程计算游离氨基酸含量。

(4) 水浸出物含量：参照GB/T 8305—2013，将黄金抹茶沸水浴浸提后趁热减压过滤，用沸蒸馏水洗涤数次后将茶渣连同滤纸移入烘皿后立即干燥直至恒重，最后称量计算结果。

(5) 感官评定：参照Ikeda等[22]和李东娜等[23]的方法，称取3.0 g抹茶，用80 ℃水在白瓷审评碗中冲泡5 min，由10位有经验的审评员采用密码审评法，对茶样的色泽、汤色、香气和滋味进行感官评分，其中色泽评分、汤色评分、香气评分、滋味评分分别占总分的30%，10%，30%，30%。

1.2.5 数据处理 所有试验重复进行3次或3次以上，结果用平均值表示，运用Excel 2003、Origin 9.0以及Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计筛选关键因素

在预试验的基础上利用Plackett-Burman试验设计考察碱液质量百分浓度、料液比、蒸青叶层厚度、碱液浸泡时间、蒸青时间5个因素对叶绿素含量的影响，并筛选出显著影响因素，各因素的水平取值及试验结果见表1和表2。

根据表2的结果对数据进行回归分析，得到对黄金抹茶叶绿素含量影响的一次回归方程：

Y=2.080+0.051X1+0.021X2-2.282×10-3X3+0.024X4-0.026X5。

(3)

表1 Plackett-Burman试验因素及水平取值

表2 Plackett-Burman试验结果

表3 Plackett-Burman试验方差分析†

2.2 最陡爬坡试验确定最佳中心点

根据3个显著因素的系数设计爬坡方向和步长，其中碱液质量百分浓度、碱液浸泡时间为正效应，取其高水平；蒸青时间为负效应，取其低水平。表4为最陡爬坡试验设计及结果。

表4结果表明黄金抹茶叶绿素含量在第3组达到最高，说明最优点存在于第3组附近。因此以碱液质量百分浓度为0.15%、浸泡时间20 min、蒸青时间90 s为响应面试验中心点，进行响应面优化。

2.3 Box-Behnken响应面优化分析

以碱液质量百分浓度、碱液浸泡时间和蒸青时间为自变量，叶绿素含量为响应值进行响应面优化，护绿工艺响应面试验因素水平设计见表5，结果见表6。

利用Design Expert 8.0.6软件进行多元回归方程拟合和方差分析，得到自变量的二次项回归程：

(4)

表4 最陡爬坡试验设计及结果

表5 Box-Behnken试验因素及水平取值

图1(a)和(b)显示蒸青时间为0水平时，随着碱液质量百分浓度从0.10%增加到0.20%，碱液浸泡时间从75 s增加到105 s，叶绿素含量先上升后下降。图1(c)和(d)显示碱液浸泡时间为0水平时，叶绿素含量随碱液质量百分浓度及浸泡时间的增加呈先增加后降低的趋势。图1(e)和(f)显示叶绿素含量随碱液浸泡时间和蒸青时间的增加也呈先增加后降低的趋势。

通过Design-Expert 8.0.6软件对模型进行优化分析得出的最佳工艺为碱液质量百分浓度0.16%，碱液浸泡时间20.33 min，蒸青时间92 s。为了在实际操作中的便利性，将最佳工艺修正为碱液质量百分浓度0.15%，碱液浸泡时间20 min，蒸青时间92 s，蒸青叶层厚度1 cm，料液比(m黄金茶∶V碱液)为1∶20 (g/mL)。为验证该方法的准确性，采用上述所得最佳工艺进行3次验证实验，叶绿素平均含量为2.25 mg/g，与理论预测值基本符合，说明该回归方程能够真实地反映各因素对黄金抹茶叶绿素含量的影响。

2.4 不同加工方式黄金抹茶品质比较

2.4.1 主要化学成分 如表8所示，与传统蒸青和滚筒杀青相比，碱液浸泡蒸青黄金抹茶的叶绿素含量分别提高了25.78%，40.44%；与滚筒杀青相比，传统蒸青和碱液浸泡蒸青黄金抹茶的茶多酚含量增加4.44%，7.10%，游离氨基酸含量增加11.91%，9.97%，而传统蒸青与碱液浸泡蒸青之间无显著差异；3种方式制备的黄金抹茶水浸出物含量存在显著性差异。可能原因是，炒青时茶叶升温较慢，破坏酶活性的时间较长，同时鲜叶与高温筒壁接触摩擦，使得叶绿素破坏量较多；蒸汽杀青过程中茶鲜叶在短时间内被高温蒸汽穿透，迅速地破坏酶活使叶绿素保留下来。经碱液浸泡的抹茶叶绿素含量更高，碱性环境使得叶绿素在高温的杀青过程中受到保护，保证抹茶翠绿的色泽。茶多酚和游离氨基酸是决定抹茶滋味的重要物质，酚氨比低的抹茶滋味更加鲜爽。由表8可知，传统蒸青的黄金抹茶的酚氨比最高，碱液浸泡蒸青处理的其次，但与传统蒸青的无显著差异。综上，蒸汽杀青相比于滚筒杀青能较大程度地保留抹茶主要内含物质，而碱液浸泡在蒸青的基础上进一步减少了叶绿素的损失，保证了高品质抹茶翠绿的色泽，且不会对茶多酚、游离氨基酸等其他内含物造成不良影响。

表6 Box-Behnken响应面试验结果

表7 回归模型方差分析及结果†

图1 两因素间交互作用响应面及其等高线图

2.4.2 感官品质 由表9可知：抹茶色泽差异较明显，碱液浸泡蒸青抹茶外观色泽翠绿明亮，传统蒸青抹茶次之，而炒青抹茶整体色泽偏黄、欠明，与上述成分分析中叶绿素含量的变化相符合。蒸汽杀青的滋味较为醇和，而炒青的滋味平和略涩，还带有高火和焦味。传统蒸汽杀青所需时间短、受热较为均匀且尽可能避免了茶叶与传热仪器的摩擦接触，保证了抹茶较为纯正的香味，碱液浸泡前处理对其影响不大，但与炒青相比差异明显。

表8 黄金抹茶品质比较†

表9 黄金抹茶品质的感官评分结果

3 结论

试验最终得到的碱液浸泡蒸青最佳护绿工艺为：碱液质量百分浓度0.15%，碱液浸泡时间20 min，蒸青时间92 s，蒸青叶层厚度1 cm，料液比(m黄金茶∶V碱液)1∶20 (g/mL)。碱液浸泡蒸青护绿工艺可显著提高黄金抹茶叶绿素含量，与传统蒸青和滚筒杀青所得黄金抹茶相比，叶绿素含量分别提高了25.78%，40.44%；且不会对蒸青过程中其他内含成分造成不良影响，感观品质好。试验从工艺优化角度对黄金抹茶护绿工艺进行了研究，但未能对研制过程中叶绿素降解机理及其他护绿作用机制进行深入探究，后续可对此进行研究并探讨其作用机制。