超高效液相色谱串联质谱法测定豆芽中恩诺沙星、环丙沙星残留量的不确定度评定

施元旭 张水锋 潘项捷 冯婷婷 王璐璐

(浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江 杭州 310018)

豆芽品种丰富，营养全面，深受百姓喜爱。但豆芽需要在湿度较高的环境中才能发芽[1]，而高湿度的环境又容易造成豆芽的根部溃烂腐败。同时，不良商家为了追求豆芽的生产速率和豆芽的外表品质，会在豆芽的生长过程中非法添加抗生素类药物[2-3]、杀菌剂[4-5]等对人体有害的物质，使得“毒豆芽”的问题层出不穷。如喷洒恩诺沙星和环丙沙星药剂，其主要目的是为了防止根部腐烂。从食品安全角度来看，豆芽中残留的恩诺沙星和环丙沙星会对人体产生一定的危害，长期使用将对人体造成不可逆转的伤害[6-8]。

恩诺沙星和环丙沙星属于化学合成的喹诺酮类抗菌药物，具有光谱抗菌活性，对革兰氏阴性菌有很强的杀灭作用[9-11]。但长期食用有恩诺沙星和环丙沙星残留的豆芽，会导致人体的中枢神经系统出现严重的功能性疾病。严重时，可使人出现肌无力或呼吸肌无力进而危害生命，且还具有一定的遗传性和致癌性[12]。

评定测量结果的不确定度可以保证检测结果更加准确，同时，通过不确定度的评价也可以判定试验结果质量的高低。因此，不确定度的评价是实验室质量体系的重要组成部分[13-15]。目前，较多文献[16-18]报道研究豆芽中有恩诺沙星和环丙沙星的检出，但中国还未制定豆芽中恩诺沙星和环丙沙星残留量检测的国家标准或行业标准。试验拟采用酸化乙腈提取，过prime HLB柱净化，氮吹浓缩前处理方法，应用液相色谱—串联质谱技术对豆芽中恩诺沙星和环丙沙星的残留量进行测定。依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》评定豆芽中恩诺沙星和环丙沙星残留量检测的不确定度，有助于为豆芽品质评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆芽：市售；

恩诺沙星、环丙沙星：德国Dr.Ehrenstorfer公司；

恩诺沙星-D5、环丙沙星-D8：北京Bepure公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国Meker公司；

甲酸：色谱纯，美国ROE Scientific公司；

超高效液相色谱—串联质谱仪：Agilent 1290-AB Sciex 5500型，美国AB Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 称取5.0 g豆芽于50 mL高速离心管中，准确加入内标工作液，涡旋混合均匀。加入10 g氯化钠，涡旋混匀，再加入8 mL乙腈，20 μL甲酸，涡旋混合1 min，振荡提取10 min。高速冷冻离心后，取上清液过prime HLB小柱，并直接接取流出液。样品过柱后，用2 mL 乙腈淋洗小柱。接取流出液在40 ℃条件下N2吹干，1.0 mL初始流动相定容，过膜上机测试。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱：Aglient RRHD SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温35 ℃；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸水；流速0.2 mL/min；进样量5 μL；液相色谱梯度洗脱程序：0～1 min，90% B；1.0～3.0 min，90%～10% B；3.0～3.5 min，10% B；3.5～5.0 min，10%～90% B；5.0～6.0 min，90% B。

1.2.3 质谱条件 电喷雾(ESI)离子源：正离子模式；扫描模式：多反应检测(MRM)；喷雾电压5.0 kV；脱溶剂气温度550 ℃；气帘气压力241 kPa；雾化气压力345 kPa。其他参数见表1。

表1 恩诺沙星和环丙沙星的主要质谱参数†

1.2.4 数学模型

(1)

式中：

X——样品中恩诺沙星或环丙沙星的含量，μg/kg；

C——样品中恩诺沙星或环丙沙星测定浓度，μg/L；

V——提取液的定容体积，mL；

m——样品质量，g；

fr——待测物质的回收率，%；

fQ——液相色谱串联质谱校正影响因子。

2 结果与分析

2.1 样品的不确定度来源

根据试验检测步骤和建立的数学模型，超高效液相色谱—串联质谱法测定豆芽中恩诺沙星和环丙沙星残留量的不确定度主要有以下几个方面：① 测试过程随机效应引入的不确定度urel(X)；② 称样量引入的不确定度urel(m)；③ 样品定容引入的不确定度urel(V)；④ 标准曲线拟合的不确定度urel(curve)；⑤ 标准溶液配制的不确定度urel(c)；⑥ 回收率测试过程随机效应的不确定度urel(fr)；⑦ 仪器分析的不确定度urel(fQ)。

2.2 不确定度的评定

2.2.1 测试过程随机效应引入的不确定度urel(X) 包括样品制备过程的均匀性、样品提取液和定溶液的浓度和纯度、电子天平的稳定性、移液器和容量瓶定容等因素引入的不确定度。

平行测定6份样品(n=6)，用液相色谱串联质谱测定，结果见表2。用贝塞尔公式[式(2)～(4)]计算，单个测得值的标准偏差、标准不确定度及相对标准不确定度。

(2)

(3)

(4)

表2 测试过程随机效应引入的不确定度urel(X)计算结果

2.2.4 标准曲线拟合引入的不确定度urel(curve) 配制5个不同质量浓度的标准溶液绘制标准曲线，每个浓度点的标准溶液分别重复测定3次，以标准溶液浓度Xi(μg/L)为横坐标，以标准溶液外标峰面积值(A外标)与内标峰面积值(A内标)的比值为纵坐标，用最小二乘法拟合，线性回归方程以及线性相关系数R2见表3。

分别重复测定样品溶液6次(p=6)，计算线性回归方程导致x0的标准不确定度

(5)

urel(curve)=u(curve)/x0，

(6)

式中：

S——标准曲线的标准偏差；

x0——样品溶液平均浓度，μg/L；

b——斜率；

a——截距；

n——测试标准溶液的试验总次数(每个标准溶液点测试3次×5个不同质量浓度的点)，n=15。

计算结果见表4。

2.2.5 标准溶液配制过程引入的不确定度urel(c) 标准溶液配制过程引入的不确定度主要包括恩诺沙星、环丙沙星标准品的纯度、标准品称量和定容，标准溶液稀释定容、标准曲线配制引入的不确定度。

(1) 原始标准物质引入的不确定度：恩诺沙星的纯度为99.9%，标准不确定度为1.25%，取包含因子k=2，其相对标准不确定度u(P1)=1.25%/2=0.006 25，urel(P1)=0.006 25/0.999=0.006 256。环丙沙星的纯度为92.31%，标准不确定度为0.66%，取包含因子k=2，相对标准不确定度u(P2)=0.66%/2=0.003 3，urel(P2)=0.003 3/0.923 1=0.003 575。

恩诺沙星内标的纯度为95.3%，标准不确定度为1%，取包含因子k=2，相对标准不确定度u(P3)=1%/2=0.005，urel(P3)=0.005/0.953=0.005 247。环丙沙星内标的纯度为(94.8±1.0)%，标准不确定度为1%，取包含因子k=2，相对标准不确定度u(P4)=1%/2=0.005，urel(P4)=0.005/0.948=0.005 274。

恩诺沙星标准物质纯度和内标物质纯度合成相对不确定度为：

环丙沙星标准物质纯度和内标物质纯度合成相对不确定度为：

表3 恩诺沙星和环丙沙星残留量线性回归方程及相关系数

表4 urel(curve)计算结果

内标物质均为10 mg，一次性溶解，不存在由于称量而产生的不确定度。

(3) 标准储备液定容引入的不确定度：标准储备液定容引入的不确定度来源分别为定容液的体积膨胀引入的不确定度和10 mL容量瓶引入的不确定。

恩诺沙星标准溶液稀释引入的合成相对不确定度为：

同理，环丙沙星标准溶液稀释引入的合成相对不确定度为：urel(c环3)=0.012 01。

恩诺沙星内标溶液稀释引入的合成相对不确定度为：

同理，环丙沙星内标溶液稀释引入的合成相对不确定度为：urel(c环4)=0.011 99。

10 mL容量瓶定容引入的不确定度，可根据2.2.5(3)的计算方法，得到的相对不确定度urel(c10 mL)=0.003 283。

配制恩诺沙星标准曲线引入的合成相对不确定度：

样品中添加恩诺沙星内标引入的合成相对不确定度：

因此，配制环丙沙星标准曲线引入的相对不确定度urel(c环5)=0.056 31；样品中添加环丙沙星内标引入的相对不确定度urel(c环6)=0.012 01。

标准曲线稀配制过程和样品中添加内标引入的合成相对不确定度为：

urel(c环)=0.060 67。

2.2.6 回收率测试过程随机效应引入的不确定度urel(fr) 由于目标化合物从样品基质中不能完全提取出来，加上提取、氮吹过程的损失导致了较大的不确定度，对样品前处理产生的不确定度用回收率方法来计算。

按照方法的要求对同一个样品重复加标6次(n=6)，上机测定恩诺沙星和环丙沙星的加标回收率，结果见表5。根据式(7)计算得到6次试验结果的标准偏差s(X)，式(8)计算得到回收率测试过程中引入的相对不确定度。

(7)

(8)

表5 urel(fr)计算结果

2.2.7 检测仪器引入的不确定度urel(fQ) 由《超高效液相色谱—串联质谱 仪器校准证书》知，urel(fQ)=2%。

2.3 合成不确定度

恩诺沙星和环丙沙星的相对不确定度分量表见表6，若不考虑各不确定度的相关性，则其合成不确定度按式(9) 计算。

(9)

通过式(9)求得：urel(W恩)=0.087 08；urel(W环)=0.104 2。

2.4 扩展不确定度及结果表示

根据CNAS-GL006:2018《化学分析中不确定度的评估指南》，取包含因子k=2(95%置信度)时，扩展不确定度U=urel(W)×2×X，由此得到豆芽中恩诺沙星和环丙沙星的测量结果，见表7。

表6 恩诺沙星和环丙沙星相对不确定度分量

表7 豆芽中恩诺沙星和环丙沙星不确定度评定结果

3 结论

试验以豆芽为研究对象，采用0.1%酸化乙腈提取，prime HLB固相萃取小柱净化，应用超高效液相色谱—串联质谱法对豆芽中恩诺沙星和环丙沙星的残留量进行测定。根据数学模型，对豆芽中恩诺沙星和环丙沙星残留量的不确定度各分量进行评定，评定结果表明，测定结果的不确定度最主要来源于标准曲线的拟合和标准溶液的配置过程，其次是仪器的影响和回收率，其他因素的影响较小。因此，试验过程中，需要操作人员增加试验的平行次数以及标准溶液的测定次数，维护好检测仪器的性能，使其有足够的灵敏度和精密度，定期做好仪器期间核查和校准检定，减少因仪器引入的不确定度。定期对恩诺沙星和环丙沙星的标准溶液期间核查，保证标准物质的可靠性，从而保证试验结果的准确可靠。同样，称量样品时，可考虑选取精度更高的电子天平，或增加称样量，来减少称样过程引入的不确定度，从而提高试验结果的准确度。