辣木籽水提物对酒精诱导线虫运动功能障碍的影响

彭 颖

(长沙商贸旅游职业技术学院，湖南 长沙 410116)

长期大量饮酒不仅引起酒精嗜好性，而且影响机体代谢平衡。乙醇氧化分解产生大量乙醛及自由基，损伤肝胃等器官，还阻断神经信号的传送，使机体的运动不协调、不受控制[1]，甚至酒精中毒。虽然药物能缓解酒精毒性，但对机体会造成一定的负面作用，因此，天然植物提取物成为了学者们关注的热点。

辣木籽是辣树的种子，原产于印度，如今在亚洲、非洲、中美洲等地已被大规模种植。辣木籽因其营养丰富，已有直接食用或粗加工作为食品辅料的饮食史。研究表明，辣木籽含有丰富的挥发性油、维生素、黄酮、多酚、多糖、生物碱和皂苷等成分[2-3]，而且其水提液和醇提液具有抗氧化能力[4]，可以通过降低氧化应激以抵抗炎症反应的发生[5]，能显著降低乙醇诱导的肝脏脂质过氧化[6]。近年来，对辣木籽抗氧化能力的研究较多，但研究其解酒能力的较少，而且未见辣木籽水提物减弱酒精对运动神经影响的文献报道。黄颖等[7]研究发现辣木籽中的多酚物质能显著提升肝脏乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶活力，降低血液酒精浓度。但未从行为学及神经代谢酶角度分析辣木籽的解酒水平。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)又称为线虫，其神经系统结构简单，功能完善，是神经活性物质靶标测定的理想动物模型[8]。研究拟以线虫为模式生物，研究辣木籽水提物对酒精胁迫运动功能障碍的影响，以期为辣木籽的解酒功效提供表征层面上的理论依据，促进辣木籽资源的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌(E.coliOP50)、野生型秀丽隐杆线虫(the Bristol strain N2)：国际线虫遗传中心；

辣木籽：云南元江县苍源林果科技有限公司；

无水乙醇、氯化钙、氯化钠、氢氧化钠、硫酸镁、蛋白胨、琼脂、酵母粉等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

5-氟尿嘧啶脱氧核苷(FUDR)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

钙调神经磷酸酶(CaN)试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；

乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒：索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温培养箱：MJX-250B-Z型，上海博迅实业有限公司；

冷冻离心机：TGL-20M型，长沙英泰仪器有限公司；

倒置荧光显微镜：TS2R型，成贯仪器(上海)有限公司；

气相色谱仪：6890N型，上海本昂科学仪器有限公司；

酶标仪：Multiskan FC型，济南来宝医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 辣木籽剥皮后，种子经干燥粉碎，过60目筛。以料液比1∶10 (g/mL)加入超纯水，95 ℃浸提1 h，重复操作两次，合并两次滤液，经浓缩后冻干备用。辣木籽水提物的提取效率为18.34%。

1.3.2 秀丽隐杆线虫的同期化与培养 参照文献[9]。用于试验的线虫采用液体培养(培养液即虫液)，干预时虫液的终浓度控制在(200±10)条/mL。为避免个体差异对试验结果造成影响，秀丽隐杆线虫经同期化3次后，方能用于各指标的检测。

1.3.3 试验分组及药物处理 课题组[10]前期研究表明，在3%酒精浓度干预下，线虫表现出醉酒的生理状态，因此选用3%的酒精浓度进行醉酒线虫的造模。

同期化后的线虫生长至L4期，完成幼虫阶段最后一次蜕皮进入成虫期时，加入终浓度为0.12 mmol/L的FUDR溶液，以抑制线虫产卵及卵的孵出。12 h后，将虫液分为等体积的6组至三角瓶中，分别为：A组(空白组)，B组(对照组，酒精浓度为3%)，C～F组为辣木籽水提物干预试验组。辣木籽水提物粉末用3%酒精溶液溶解，并通过0.22 μm的过滤膜，使C～F组中辣木籽的终浓度分别为10，20，30，40 mg/mL，酒精浓度为3%。每组设3个平行。

1.3.4 线虫头部摆动频率的测定 参照文献[11-12]。在20 ℃下轻微震荡培养24 h后分别吸取各组虫液15 μL于NGM板上(每个板上线虫数量为30条左右)，待线虫恢复运动5 min后，在体视显微镜下观察并记录30 s内每条线虫头部的摆动次数。线虫头部摆动频率定义为线虫头部从一侧摆向另一侧，角度>90°记为摆动1次。

1.3.5 线虫吞咽频率的测定 在20 ℃下轻微震荡培养24 h后分别吸取各组虫液15 μL于NGM板上(每个板上线虫数量为30条左右)，待线虫恢复运动5 min后，在体视显微镜下观察并记录30 s内每条线虫的咽部吞咽次数，作为线虫吞咽频率的指标[13]。

1.3.6 线虫运动轨迹的测定 线虫干预24 h后，移取10 μL 虫液于没有食物的NGM板上，让其自由运动2 min，观察各组线虫在NGM板上的运动轨迹并拍照，收集线虫运动轨迹的横波和纵波波长，综合分析各组线虫的运动性能。

1.3.7 线虫内部酒精浓度的测定 采用气相色谱法[14-15]。

(1) 预处理：线虫干预结束后，于2 500 r/min离心2 min 收集虫体，并用0.9%生理盐水清洗虫体3遍。再次离心去除上清液，用无菌水将虫液重悬至1 mL，在冰水浴中进行超声破碎(超声3 s，间隔3 s，工作时间3 min)。于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。在上清中加入终浓度为0.002%的正丁醇，样品待测液经0.22 μm 无机滤膜过滤后，上机待测。用同样方法制备平行样，供上机测试。

(2) 色谱条件：色谱柱为HP-INNO Wax毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。柱温60 ℃保持3 min，以10 ℃/min的升温速率升至80 ℃，共6.5 min，检测器温度250 ℃；载气(氮气)流速1.2 mL/min；不分流模式，进样量0.5 μL。

(3) 酒精标准曲线制作：以0.002%的正丁醇作为内标，分别加入0.000 5%，0.001 0%，0.002 0%，0.003 0%，0.004 0% 终浓度的乙醇标品，进行标曲的制作。标准曲线方程为：Y=25 036X-0.058 2，R2=0.999 7。

1.3.8 线虫钙调神经磷酸酶、乙酰胆碱酯酶的测定 线虫在干预24 h后，处理方式同1.3.7(1)。用M9清洗虫体3遍，在冰水浴下进行细胞破碎，提取蛋白提取液，用于钙调神经磷酸酶、乙酰胆碱酯酶的检测。检测方法参照试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 辣木籽水提物对线虫头部摆动频率的影响

由图1可知，对照组线虫的头部摆动频率显著低于空白组(P<0.05)，说明线虫在3%酒精浓度干预下，酒精阻碍线虫头部的摆动，导致线虫处于酒精胁迫的状态。相比对照组，药物组(C～F)的线虫头部摆动频率随辣木籽水提物浓度的增加呈下降的趋势，当辣木籽水提物浓度达到40 mg/mL(F组)时线虫的头部运动受到限制，与对照组无显著差异(P>0.05)，说明辣木籽水提物浓度过高对线虫头部摆动有限制作用；当辣木籽水提物浓度为10 mg/mL(C组)时线虫的头部运动较对照组有显著提高(P<0.05)，说明低浓度的辣木籽水提物能保护线虫的摆头运动。

2.2 辣木籽水提物对线虫吞咽频率的影响

在液体培养环境中，线虫会保持不断吞咽的状态。造模后，线虫体内的酒精浓度较高，会麻痹神经元，导致其陷入昏睡状态，逐渐减慢吞咽频率。从图2可以看出，对照组的线虫在酒精的干预下，吞咽速度显著减缓(P<0.05)，相比空白组线虫的正常吞咽速度下降了41.45%。而加入低浓度辣木籽水提物(10，20 mg/mL)的线虫较对照组吞咽次数明显增加(P<0.05)，且在10 mg/mL水提物作用下的线虫的吞咽次数是对照组的1.46倍。说明低浓度的辣木籽水提物可以缓解酒精对线虫的麻痹作用，缓解酒精诱导线虫昏睡、停止进食的状态。

低浓度(10 mg/mL)的辣木籽水提物对线虫的头部摆动运动及吞咽运动均能起到保护作用，减弱酒精导致线虫的运动障碍。有研究[16]发现，辣木籽能明显改善认知功能障碍和神经元损伤，对神经系统具有保护作用。因此，这可能与辣木籽水提物能保护运动神经有关。

2.3 辣木籽水提物对线虫运动能力的影响

由图3可知，线虫正常的运动轨迹为一条径直的正弦波长(A组)，而B组中线虫受酒精的影响，其运动能力受到抑制，无法正常摆动身体，运动曲线趋向于平缓，无明显的波峰。说明酒精能在一定程度上阻碍线虫的正常运动，使线虫拖尾爬行。而C组(10 mg/mL)线虫的运动轨迹基本和正常情况下的线虫保持一致，但随着辣木籽水提物添加浓度的增大，线虫的运动能力并没有得到恢复。说明低浓度的辣木籽水提物可以减少酒精对线虫运动能力的抑制，在整体上保护线虫免受酒精的损伤。而高浓度的辣木籽水提物则不能协助线虫恢复运动能力，无法抵抗酒精损伤。Sousa等[17]报道了经高温处理的高、低浓度的辣木籽提取物对线虫毒害作用及其对线虫运动性的影响。高浓度的辣木籽提取物经高温处理后，对线虫的毒害作用以及对线虫运动性的影响与未经高温处理组对比，没有显著性差异。而低浓度的五味子提取物经高温处理后，其对线虫致死率以及对线虫运动性的影响显著降低，致死率降低40%，抑制线虫运动的能力降低10%左右。因此，高浓度的辣木籽提取物不能保护线虫的正常生理活性，使线虫运动不活跃。而低浓度的提取物却没有明显的负面作用。

图1 各试验组线虫的头部摆动频率

图2 各试验组线虫的咽泵运动频率

2.4 线虫组织内部乙醇浓度

检测了线虫在酒精或辣木籽水提物组干预24 h后，其体内乙醇积累的浓度，检测结果如图4所示。各辣木籽水提物组线虫的体内乙醇浓度较对照组的均显著下降(P<0.05)，但随着辣木籽水提物浓度的增大，线虫体内积累的乙醇浓度又逐渐升高。其中10 mg/mL辣木籽水提物组较对照组来说，线虫体内乙醇浓度下降了63.95%，而40 mg/mL辣木籽水提物组线虫体内乙醇浓度仅比对照组下降了12.98%。说明低浓度的辣木籽水提物有助于线虫减少乙醇在体内的积累。但高浓度的辣木籽水提物不能有同样的效果，可能是由于线虫在摄入食物的同时也在摄入酒精，而辣木籽水提物对线虫有一定的量效关系，浓度过高会降低线虫的代谢活力，导致其体内的酒精无法及时被代谢。

图3 各试验组线虫的运动轨迹图

2.5 线虫体内神经相关酶活力

酒精摄入后，打破了机体的正常代谢，引起线虫体内相关酶活的变化。钙调神经磷酸酶(CaN)在细胞信号传递中直接受Ca2+的调节，参与神经信号传导，调节机体在运动中对刺激的适应过程[18]。如图5(a)所示，对照组与空白组相比，酒精的刺激，显著提高了线虫体内CaN的酶活力(P<0.05)。而在低浓度辣木籽水提物(10，20 mg/mL)干预下，线虫体内的CaN的酶活力处于动态平衡，与空白组无显著性差异(P>0.05)，但较对照组显著降低了CaN酶活力(P<0.05)。

图4 各试验组线虫组织内部的乙醇浓度

线虫的背、腹神经索存在着神经—肌肉突触，由兴奋性神经递质乙酰胆碱(Ach)来调节肌肉活动[19]。乙酰胆碱酯酶(AchE)是一种关键性酶，可水解Ach，维持正常的肌肉生理效应[20]。如图5(b)所示，对照组与空白组相比，线虫AchE酶活力显著降低(P<0.05)，下降了40.38%；低浓度辣木籽水提物组(10 mg/mL)线虫的AchE酶活力虽低于空白组的(P<0.05)，但显著高于对照组的(P<0.05)，提高了48.63%。

研究[21-22]发现酒精的摄入，使线虫体内酒精积累过多，刺激CaN的过表达，且抑制了AchE的酶活力。这可能是由于外源酒精的刺激，Ca2+离子通道被打开，造成Ca2+大量外流入胞浆，Ca2+在胞浆中的浓度升高，激活了CaN的酶活性，从而CaN活性升高。CaN具有促进神经元释放神经递质、肌肉组织发育的作用，增强了Ach释放到肌肉组织中。然而酒精抑制了AchE酶活力，因此无法及时分解Ach，会引起神经—肌肉接头处Ach下降，使运动神经—肌肉兴奋冲动受阻，导致运动能力的下降。而低浓度的辣木籽水提物通过减少酒精在线虫体内的积累，以降低外来刺激，维持钙调神经磷酸酶酶活力的动态平衡，并有效激活了乙酰胆碱酯酶的酶活性，能及时清除突触间隙—肌肉中堆积的Ach，维持着较高的生物活性，使得生理信息得以正确的传递，因而线虫能快速适应外来环境，保持正常的生理运动。

图5 各试验组线虫体内神经相关酶的活力

3 结论

水提物试验从表征指标、体内酒精浓度积累以及2种神经调节相关酶活性方面证实，低浓度的辣木籽水提物能在一定程度上保护线虫免受酒精的刺激，具有缓解酒精毒性的作用。但未能明晰具体的作用物质，且未深入到基因水平去挖掘作用机制。因此，下一阶段可进一步研究水提物的具体成分，以及对运动神经通路的影响，并深入研究辣木籽水提物各组分对机体内部的整体调控作用，探寻作用靶点调节机体的整体代谢水平的机制。