紫苏叶多酚超声辅助聚乙二醇提取工艺优化及抗氧化活性研究

2020-11-09 04:17茹巧美任国平
食品与机械 2020年10期
关键词:紫苏叶液料聚乙二醇

茹巧美 任国平 胡 琼

(杭州万向职业技术学院康养旅游系,浙江 杭州 310023)

紫苏[Perillafrutescens(L.) Britt]系唇形科一年生草本植物,广泛分布于东南亚国家,是中国卫生部颁布的第一批药食同源植物[1]。紫苏叶具有抗过敏、抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗抑郁、止咳作用,主要归因于其高含量生物活性物质,特别是酚类、黄酮、三萜类、挥发性化合物等[2]。

常见的多酚提取方法主要有超临界流体萃取[3]、加压液相萃取[4]、酶解法[5]和溶剂浸提法[6]等。溶剂浸提多酚是一种较为传统的操作,其中乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等是提取多酚的主要有机溶剂[7]。近年来,亚临界水[8]、β-环糊精[9]、深度共晶溶剂—甘油水溶液[10]等多酚绿色提取剂已被开发。聚乙二醇是一种非挥发性且具有一定稳定性的有机溶剂,与水有良好的混溶性且成本低,是一种环境友好型溶剂,被广泛应用于双水相萃取以及浊点萃取等提取试验[11]。试验拟以紫苏叶为原料,采用超声辅助聚乙二醇提取紫苏叶多酚并研究其抗氧化活性,旨在为紫苏叶多酚的绿色提取及工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫苏叶:红叶紫苏,产地浙江湖州;

聚乙二醇-200(平均分子量为200的聚乙二醇)、没食子酸(GAE):分析纯,阿拉丁试剂(上海)有限公司;

其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

超声波清洗器:KH5200DB型,昆山禾创超声仪器有限公司;

电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9240A型,上海精宏实验设备有限公司;

电子天平:BSA224S型,赛多利斯科学仪器有限公司;

台式高速冷冻离心机:TGL-16M型,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;

旋转蒸发器:R502B型,上海申生科技有限公司;

紫外—可见分光光度计:UV-5800PC型,上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜无虫害紫苏叶洗净,自然风干后磨粉过200目筛,装袋密封后于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 紫苏叶多酚提取工艺 取适量紫苏叶粉,与聚乙二醇混合均匀,在不同条件下进行超声波辅助(超声频率40 kHz)提取,迅速冷却至室温,11 000 r/min离心20 min,收集上清液,测定多酚含量。

1.2.3 单因素试验

(1) 聚乙二醇浓度:固定液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g),超声功率140 W,超声时间40 min,考察聚乙二醇浓度(50%,60%,70%,80%,90%)对多酚提取率的影响。

(2) 液料比:固定聚乙二醇浓度70%,超声功率140 W,超声时间40 min,考察液料比[V聚乙二醇∶m紫苏叶为10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1 (mL/g)]对多酚提取率的影响。

(3) 超声功率:固定聚乙二醇浓度70%,液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g),超声时间40 min,考察超声功率(100,120,140,160,180,200 W)对多酚提取率的影响。

(4) 超声时间:固定聚乙二醇浓度70%,液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)30∶1 (mL/g),超声功率140 W,考察提取时间(20,30,40,50,60 min)对多酚提取率的影响。

1.2.4 响应面试验 基于单因素试验结果,根据Box-Behnken中心原理,以聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间为自变量,多酚提取率为响应值设计响应面分析试验。

1.2.5 多酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法[12]。

1.2.6 抗氧化活性测定

(1) ·OH清除率:参照Shen等[13]的方法稍作改动。分别取1.0 mL水杨酸(6 mmol/L)、0.5 mL FeSO4(17.5 mmol/L)于比色管中,加入1.0 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液,再加入0.5 mL H2O2(8.8 mmol/L)启动反应,37 ℃水浴30 min,测定532 nm处吸光度,以70%聚乙二醇代替样品溶液为空白组,以去离子水代替H2O2为对照组,按式(1)计算·OH清除率。

(1)

式中:

E——自由基清除率,%;

A0——空白组吸光度;

A1——样品组吸光度;

A2——对照组吸光度。

(3) DPPH·清除率:参照Pandey等[15]的方法略作改动。取1.0 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液,加入3.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液摇匀,避光室温保存30 min,测定517 nm处吸光度,以70%聚乙二醇溶液作空白,按式(1)计算DPPH·清除率。

(4) 还原力:参照Rozi等[16]的方法略修改。取1 mL不同质量浓度的紫苏叶多酚溶液,加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6),2.5 mL铁氰化钾(1.0%),混匀,50 ℃水浴20 min,以2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应。3 000 r/min 离心10 min,取上清液5 mL,加入4 mL去离子水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液,混匀,室温放置10 min,测定700 nm处吸光度。

1.3 数据处理

所有试验平行3次,采用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计与统计分析;采用SPSS 22.0、Origin 9.0软件进行数据处理与制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 聚乙二醇浓度对紫苏叶多酚提取率的影响 由图1 可知,多酚提取率随聚乙二醇浓度的增加先增大后降低,当聚乙二醇浓度为60%时多酚提取率最大,为17.92 mg GAE/g·DW。这可能是有一部分植物多酚以与蛋白质结合的形式存在,有机溶剂浓度过高会使蛋白质变性,不利于此部分多酚溶出[17]。因此,确定聚乙二醇浓度为60%。

2.1.2 液料比对紫苏叶多酚提取率的影响 由图2可知,多酚提取率随液料比的增加先显著增加后略有下降,当液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)为40∶1 (mL/g)时多酚提取率最高,为17.55 mg GAE/g·DW。这主要是因为增加液料比,固液两相的接触面积增加,同时溶质与溶剂之间的浓度差增大,有利于多酚物质由原料向溶剂扩散,聚乙二醇中溶解的多酚也不断增多;而过多的提取剂导致其他杂质成分如半纤维素、叶绿素等的溶出量增多,影响多酚物质的提取,同时增加热负荷以及提取时间,回收溶剂成本也有所增高[18]。综合考虑,液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)固定为40∶1 (mL/g)。

图1 聚乙二醇浓度对紫苏叶多酚提取率的影响

图2 液料比对紫苏叶多酚提取率的影响

2.1.3 超声功率对紫苏叶多酚提取率的影响 由图3可知,多酚提取率随超声功率的增大先增大后明显下降,当超声功率为140 W时达最大值(17.16 mg CGE/g·DW)。这是由于超声波引起的空化效应随超声功率的增大而增强,同时提取液温度不断上升,溶液扩散速度加快,紫苏叶粉末颗粒膨胀,促使酚类物质渗透速率加快,聚乙二醇对多酚的溶解度逐渐增加,但超声功率过高,热效应显著,会导致酚类物质结构遭到破坏,部分多酚分解,提取率下降[19]。因此超声功率宜选择140 W。

2.1.4 超声时间对紫苏叶多酚提取率的影响 由图4可知,多酚提取率随超声时间的增加先增大后减少,当超声时间为60 min时提取率最高,达17.68 mg GAE/g·DW。Kazemi等[20]表明,超声辅助提取过程中,较长的超声时间有助于细胞壁的进一步破坏和酚类物质的渗透,提取率增加。而超声时间过长,多酚会氧化为醌类物质或者分解,不利于多酚提取[21]。因此,最佳超声时间为60 min。

图3 超声功率对紫苏叶多酚提取率的影响

图4 超声时间对紫苏叶多酚提取率的影响

2.2 紫苏叶多酚提取工艺参数优化

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素试验的基础上,以聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间为自变量,以多酚提取率为响应值进行四因素三水平响应面优化试验,因素水平表见表1,试验设计与结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立与方差分析 通过Design Expert 8.0.6软件对表2进行多元回归拟合,得二次多项回归方程为:

(2)

表1 响应面试验因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计与结果

2.2.3 两因素间交互作用 由图5可知,多酚提取率随聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间的增加呈先增大后减小的趋势。其中,聚乙二醇浓度和超声功率对响应值的影响大,表现曲面较陡,聚二乙醇浓度对多酚提取率的曲线更陡峭,说明聚乙二醇浓度影响更大;而液料比和超声时间的曲面相对较平缓,说明对多酚提取率影响较小。聚乙二醇浓度与超声功率的交互作用显著,但其余各因素间的交互作用不显著,与表3结果相符,说明该模型可以较好地描述聚乙二醇浓度、液料比、超声功率和超声时间4个因素对紫苏叶多酚提取率的影响。

表3 回归模型方差分析†

2.2.4 最佳工艺条件预测与验证实验 由Design Expert 8.0.6软件预测紫苏叶多酚的最佳提取条件为:聚乙二醇浓度68.31%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46.00∶1 (mL/g)、超声功率157.18 W、超声时间67.45 min。考虑实际条件的可操作性,将最佳提取工艺调整为:聚乙二醇浓度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46∶1 (mL/g)、超声功率157 ℃、超声时间67 min。在此条件下进行3次验证实验,所得紫苏叶多酚提取率为18.21 mg GAE/g·DW,与预测值18.38 mg GAE/g·DW接近,说明该模型对紫苏叶多酚提取工艺条件参数优化可靠,具有较好的应用价值。此外,聚乙二醇—超声辅助提取的紫苏叶多酚得率略高于乙醇—微波辅助提取的(15.744 mg/g·DW)[22]。

图5 各因素交互作用对紫苏叶多酚提取率的影响

2.3 紫苏叶多酚的抗氧化活性

2.3.1 ·OH清除能力 由图6可知,当质量浓度为10~100 μg/mL时,紫苏叶多酚对·OH有明显的清除能力,且清除活性随多酚质量浓度的增加而增强。当质量浓度≤20 μg/mL时,紫苏叶多酚和维生素C对·OH的清除率没有显著差异;当质量浓度≥40 μg/mL时,紫苏叶多酚对·OH的清除率低于同质量浓度维生素C。紫苏叶多酚对·OH的最大清除率为81.69%,低于维生素C的(96.21%),且紫苏叶多酚和维生素C对·OH清除率的IC50分别为62.62,50.84 μg/mL,说明紫苏叶多酚具有较好的·OH清除能力。

图6 紫苏叶多酚对·OH的清除能力

图7 紫苏叶多酚对的清除能力

2.3.3 DPPH·清除能力 由图8可知,当质量浓度为10~100 μg/mL时,紫苏叶多酚对DPPH·的清除率随质量浓度的增加而增加;当质量浓度≤40 μg/mL时,紫苏叶多酚和维生素C对DPPH·的清除率没有显著差异;当质量浓度≥60 μg/mL时,紫苏叶多酚对DPPH·的清除率低于同质量浓度维生素C;当质量浓度为100 μg/mL时,紫苏叶多酚和维生素C对DPPH·的清除率分别为82.26%,98.87%,IC50分别为53.44,49.51 μg/mL,表明紫苏叶多酚具有较强的DPPH·清除能力。

2.3.4 还原能力 由图9可知,当质量浓度为10~100 μg/mL 时,多酚对铁离子的还原力随质量浓度的增大呈上升趋势;当质量浓度为100 μg/mL时,紫苏叶多酚还原力为维生素C的72.53%。紫苏叶多酚和维生素C对还原力的IC50分别为32.57,13.71 μg/mL,表明紫苏叶多酚具有较好的还原力。

3 结论

试验表明,超声辅助聚乙二醇提取紫苏叶多酚的最佳工艺为聚乙二醇浓度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫苏叶)46∶1 (mL/g)、超声功率157 W、超声时间67 min,此条件下多酚提取率为18.21 mg GAE/g·DW。抗氧化试验表明,紫苏叶多酚具有较好的抗氧化性能,量效关系明显,说明紫苏叶多酚可开发为食品、化妆品、药品等行业的天然抗氧化物。后续需利用大孔吸附树脂和色谱等方法进行分离纯化、结构鉴定及活性评价。

图8 紫苏叶多酚对DPPH·的清除能力

图9 紫苏叶多酚的还原能力

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