吡西达替尼抑制NLRP3通路保护脑缺血后神经功能的恢复

杜小雪 邹阳 方马荣

缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）是临床上常见的神经系统疾病之一，可引起脑内胶质细胞免疫应答和急剧的炎症反应。小胶质细胞是卒中后炎症反应最主要的细胞来源。NLRP3 是NOD 样炎症小体，在脑内参与调控小胶质细胞集落因子1 受体（CSF1R）介导的下游炎症反应，并催化促炎因子释放，加重神经损伤［1］。因此寻找抑制NLRP3 的抗炎药物对缓解脑缺血患者体内炎症和神经损伤具有重要作用。吡西达替尼（Pexidartinib）是一种新型口服小分子酪氨酸激酶抑制剂，对CSF1R 具有较强的选择抑制性。被报道作为临床抗癌前期实验药物用于腱鞘巨细胞肿瘤的Ⅰ期、Ⅲ期治疗等［2］。本研究主要从NLRP3 信号通路探究吡西达替尼对脑缺血小鼠抗炎机制的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性C57/B6J 小鼠50 只，体质量25～30g，清洁级，8 周龄。所有小鼠购自中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司，小鼠的饲养与实验操作均于浙江大学动物实验中心完成。

1.2 药物 实验用药品吡西达替尼Pexidartinib，又称PLX-3397，购自MCE 公司，目录号为HY-16749，并溶解于DMSO 溶液中至10mg/ml 备用。

1.3 试剂和仪器 抗Iba1 抗体购自Abcam 公司（兔抗，批号ab178847）；抗NLRP3 抗体购自Abcam 公司（兔抗，批号ab214185）；抗Caspase1 抗体购自Abcam公司（兔抗，批号ab179515）；抗NF-κB 抗体购自Abcam 公司（兔抗，批号ab16502）；超敏酶标羊抗兔抗体来自于北京中杉生物公司（批号107257D9）；荧光羊抗兔抗体来自武汉博士德公司（批号BA1142）；RNA 提取试剂盒购自TaKaRa 公司（批号AK1401）；SYBR PremixEx TaqTMII 购 自TaKaRa 公 司（ 批 号AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix 购 自TaKaRa公司（批号AK5101）。冰冻切片机来自德国LAIKA 公司；Olympus BX53 手动正置荧光显微镜来自Olympus公司；Bio-Rad 化学发光成像仪来自杭州宝诚生物技术有限公司；吸入麻醉机来自深圳瑞沃德公司。

1.4 实验方法 （1）动物分组。实验动物分组，将大鼠随机分为5 组，每组各10 只：①正常组；②假手术组；③DMSO 组；④脑缺血组；⑤吡西达替尼组。（2）造模。小鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤模型参照Coll 等［3］的方法建立。具体操作过程如下：小鼠称重，腹腔注射5%戊巴比妥钠（5ml/kg）麻醉。仰卧固定后，颈部正中纵切口，分离并暴露右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。结扎CCA 近心端和ECA 基底部，CCA 处剪口，用直径为0.3mm 的线栓插入右CCA 管腔，并缓慢前进至ICA 远端直至不能推进为止，约7mm。缺血90min 后缓慢将线栓拉出并结扎CCA 远端，形成再灌注损伤。缝合切口，术毕。放回笼内，单笼饲养。小鼠苏醒后左上肢屈曲、行走时左侧旋转或左侧肢体瘫痪的小鼠为堵塞成功。假手术组大鼠只分离、暴露血管，不结扎CCA 及ECA，不插入线栓。吡西达替尼组，术后连续给予吡西达替尼腹腔注射（1mg/kg）7d。DMSO 组小鼠腹腔注射与吡西达替尼组等体积的DMSO 溶剂。

1.5 神经症状评分 参照Longa 的方法进行评分。评分标准：0 分为无明显神经功能缺损症状；1 分为不能完全伸展左侧前爪；2 分为向左侧旋转；3 分为行走时向左侧倾倒；4 分为不能自行行走，意识障碍。采用双盲方式对小鼠术后行为进行评估。

1.6 标本和检测指标 麻醉所有小鼠，将每组3 只小鼠的大脑进行冰冻切片包埋。对冰冻标本进行Iba1免疫荧光检测，观察脑缺血后大脑皮层中Iba1 表达的改变。每组4 只小鼠大脑皮层组织用于实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（QPCR）检测（TaKaRa 公司RNA 提取试剂说明书，提取组织中的总RNA 进行逆转录，并测定mRNA 的表达量），观察小胶质细胞相关炎症因子TNF-α、IL-10、Arg1 和iNOS 的表达。引物序列见表1。剩下每组3 只小鼠大脑皮层组织用于Western Blot，观察NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 的蛋白表达变化。

表1 TNF-α、IL-10、Arg1、iNOS和β-Actin的引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，对于属于正态分布的五组数据应用单因素方差分析比较，并进行两两比较的q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吡西达替尼缓解脑缺血小鼠神经功能损伤 神经症状评分能够评估各组小鼠的神经行为功能情况。评分越高，神经损伤越严重。对照组和假手术组神经功能评分为0，说明这两组小鼠无损伤；脑缺血组和DMSO 组小鼠神经功能损伤显著，分别为（3.33±0.51）分和（3.16±0.75）分，与正常组比较，P＜0.001；吡西达替尼组神经功能损伤明显减轻为（1.83±0.75）分，与脑缺血组和DMSO 组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 吡西达替尼减少脑缺血再灌注小鼠大脑皮层Iba1的表达 免疫荧光检测小胶质细胞标志蛋白Iba1 在吡西达替尼治疗前后的表达变化（见图1）。统计结果显示，与假手术组和对照组比较，脑缺血组和DMSO 组的Iba1 表达显著增加（P＜0.001）。相对于脑缺血组，吡西达替尼组的Iba1 表达降低（P＜0.01）（见表2）。结果表明，吡西达替尼能够有效地抑制小胶质细胞标志蛋白Iba1 的表达。

表2 各组小鼠大脑皮层Iba1表达比较（±s）

表2 各组小鼠大脑皮层Iba1表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.001；与脑缺血组比较，#P＜0.01

组别 正常组 假手术组 脑缺血组 DMSO 组 吡西达替尼组Iba1 表达 1.01±0.41 1.10±0.30 2.70±0.14* 2.40±0.17 2.10±0.23#

2.3 吡西达替尼治疗能够抑制脑缺血后小胶质细胞相关炎症因子的表达 通过QRT-PCR 法观察脑缺血后小鼠大脑皮层小胶质细胞相关炎症TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 的表达变化。结果表明，与对照组比较， 脑 缺 血 组TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因 子的mRNA 表达显 著 增 加（P＜0.01、P＜0.001）。相 对于脑缺血组，吡西达替尼组TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因子的mRNA 表达显著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）（见表3）。结果表明，吡西达替尼通过抑制小胶质细胞相关因子TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1的表达而发挥保护神经细胞的作用。

表3 各组小鼠大脑损伤部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表达比较（±s）

表3 各组小鼠大脑损伤部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01，#P＜0.001；与脑缺血组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01，△△P＜0.001。TNF-α：肿瘤坏死因子α；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；IL-10：白介素10；Arg-1：精氨酸酶1

组别 正常组 假手术组 脑缺血组 DMSO 组 吡西达替尼组TNF-α 4.29±1.14 4.83±0.64 9.49±0.45# 10.21±1.14 7.04±0.50 △△iNOS 2.62±0.94 2.50±0.45 6.49±0.45# 6.88±0.41 4.70±0.77 △IL-10 1.23±0.21 1.17±0.16 2.43±0.11* 2.40±0.10 1.91±0.06 ▲Arg-1 1.80±0.17 1.89±0.25 3.43±0.10* 3.40±0.12 2.01±0.02 △△

2.4 吡西达替尼抑制脑缺血组NLRP3 信号通路 Western Blot 结果显示，在假手术组和对照组小鼠中，NLRP3、NF-κB 和Caspase1 低表达。脑缺血组和DMSO 组NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与脑缺血组和DMSO组比较，吡西达替尼组NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表达显著降低（P＜0.01、P＜0.001）（见图2、表4）。

图2 各组NLRP3，NF-κB和活化的Caspase1蛋白表达图

表4 各组小鼠大脑皮层NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表达比较（±s）

表4 各组小鼠大脑皮层NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.001；与脑缺血组比较，#P＜0.01，▲P＜0.001。NLRP3：NOD样受体蛋白3；NF-κB：核因子κB蛋白；Active-Capase1：活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1

组别 正常组 假手术组 脑缺血组 DMSO 组 吡西达替尼组NLRP3 0.51±0.05 0.60±0.10 1.30±0.10* 1.47±0.03 0.87±0.07 ▲NF-κB 0.71±0.05 0.65±0.05 1.13±0.07* 1.13±0.03 0.74±0.09#Active-Capase1 0.38±0.06 0.40±0.04 0.52±0.08* 0.59±0.05 0.36±0.06 ▲

3 讨论

吡西达替尼是集落刺激因子1 受体（CSF1R）的特异性抑制剂，通过抑制CSF1R 的磷酸化，对小胶质细胞的活性有重要作用。2014 年，吡西达替尼被美国食品和药物管理局（FDA）授予用于治疗色素沉着的绒毛结节性滑膜炎（PVNS）和腱鞘巨细胞肿瘤的临床研究［4］。本次研究首次在基础研究中证实吡西达替尼能显著抑制NLRP3 炎症通路，在脑缺血再灌注小鼠中实现神经保护作用。

胶质细胞免疫治疗是治疗脑卒中的新趋势。脑卒中发生后，机体自身的免疫系统会被激活进而通过免疫细胞如小胶质细胞、星形胶质细胞等的调节作用抵御损伤部位氧糖缺失［5］。同时炎症反应促使机体释放大量的TNF-α 和iNOS［6］。TNF-α 的过度表达会加重脑损伤。iNOS 表达的上调，使一氧化氮（NO）合成分泌增加，促进小胶质细胞向损伤部位聚集，进一步加重脑的损伤［7］。CSF1R 表达聚集，促进小胶质细胞形态转变，释放IL-10 和Arg1 因子，不利于患者预后。在本研究中，小鼠局灶性脑缺血损伤诱导TNF-α 和iNOS 的mRNA 表达显著增加，小胶质细胞聚集，催化Iba1 表达增加和IL-10 和Arg1 释放。而吡西达替尼能够有效降低小胶质细胞Iba1 表达，并抑制TNF-α 和iNOS 的mRNA 表达以及IL-10 和Arg1 释放，抑制局部炎症。

小胶质细胞依赖的CSF1R 炎症激活在神经免疫中起重要作用，尤其是NLRP3 炎性小体介导炎症反应［3］。NLRP3 是NOD 样受体3，能被机体各种内外源性危险信号激活后，通过活化半胱天冬酶-1（Caspase-1）进而促进 IL-1β、IL-18 的成熟和释放，引起机体的炎症反应［8］。既往的多项研究均发现，NLRP3 的激活能够增加促炎基因，包括NF-κB、iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 的 表 达［9］。本 研 究结果显示，吡西达替尼能够显著减少iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 在脑缺血组织的mRNA 表达，同时抑制NLRP3 炎症信号相关蛋白NF-κB、活化的Caspase1蛋白的表达，具有较强的抗炎和神经保护作用。

综上所述，吡西达替尼显著降低小胶质细胞相关炎症因子的mRNA 表达，抑制NLRP3 炎症信号通路的激活，进而减少局灶性脑缺血后的小胶质细胞Iba1的表达，降低神经功能评分，促进脑缺血小鼠神经功能恢复，进而实现神经保护作用。