TNF-α在调控高糖诱导肾小管上皮细胞程序性坏死过程中的作用

官颖 孟立峰

糖尿病是一组以高血糖为主要特征的代谢性疾病，现已成为我国发病率最高的慢性疾病之一［1］。糖尿病患者由于长期血糖偏高，导致各种组织，尤其是眼、肾、心脏、血管、神经等器官的慢性损害，最终导致器官功能障碍，引发各类疾病［2］。糖尿病肾病在我国糖尿病患者中的发病率呈逐年上升趋势，目前已成为终末期肾病的第二位原因。糖尿病肾病患者由于体内存在复杂的代谢紊乱过程，一旦疾病发展至终末期，常较其他原因引起的肾脏疾病更严重。因此，加深对糖尿病肾病病理过程的研究有利于延缓糖尿病肾病的疾病进程。肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-a，TNF-α）作为免疫细胞分泌的主要促炎因子可参与糖尿病肾病演变的全过程。而程序性坏死是受肿瘤坏死因子受体或模式识别受体所调控［3］。本研究通过高糖处理诱导肾小管上皮细胞（normal rat kidney epithelial cell line，NRK52E）程序性坏死的发生并阐明TNF-α 在NRK52E 程序性坏死过程中发挥的作用，加深大众对于糖尿病诱导的糖尿病肾病病理过程的认知。

1 材料与方法

1.1 细胞 大鼠NRK52E 购自中科院上海细胞库，用含有10%小牛血清的DMEM 高糖培养液置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.2 主要试剂 DMEM（high glucose）、FBS、0.05%胰酶/EDTA 均购自Gibco；无水葡萄糖购于索莱宝公司；Lenalidomide 购于中国selleck 公司；兔抗小鼠TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 单克隆抗体均购于Abcam 公司；GAPDH 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 均购于Bioworld 公司；MTS 检测试剂盒购于伯信生物公司；细胞凋亡与坏死检测试剂盒购于中国碧云天公司；TNF-α ELISA 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 细胞活性测定 将NRK52E 以每孔5000 个细胞的浓度接种至96 孔板中。用不同浓度高糖溶液处理NRK52E，通过MTS 检测试剂盒评估细胞活性。具体方法为：将MTS 染料加入每个细胞孔内并孵育3h。通过评估490nm 处的吸光度来检测细胞活性。为了实验结果的一致性，将MTS 测定重复3 次。

1.4 细胞凋亡及坏死染色 将NRK52E 培养于六孔板内，12h 后给予高糖和（或）TNF-α 抑制剂处理。继续培养48h 后，缓慢吸去原有细胞培养基，向各孔内加入1ml 细胞染色缓冲液、5µl Hoechst 染色液、5µl PI 染色液，混匀，4℃孵育30min，染色后用PBS 洗涤1 次，将六孔板置于荧光显微镜下观察，观察红色荧光和蓝色荧光强度，评估NRK52E 凋亡和坏死程度。

1.5 酶联免疫吸附双联抗体夹心法 将NRK52E 浓度调整为1×106/L，取1ml 细胞悬液接种于24 孔板中，置于细胞培养箱中孵育12h，12h 后给予高糖和（或）TNF-α 抑制剂处理，继续培养48h 后，吸取细胞培养基，在12000r/min 的速度下常温离心20min，将细胞上清液收集于EP 管中，并冻存于-20℃冰箱备用。实验时取出EP 管，迅速复溶后严格按 ELISA 试剂盒说明书进行操作，在酶标仪450nm 处读取吸光度值，并按照各自标准绘制标准曲线，计算细胞上清液中TNF-α 含量值。

1.6 Western blot 法 检 测TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 的蛋白表达水平 将NRK52E 置于PBS 液中洗涤3 次，添加细胞裂解液后置于冰上反应30min，在12000r/min 的速度下冷冻离心20min，收集上清液后应用BCA 法定量蛋白。经凝胶电泳分离和转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST 洗膜后分别加一抗GAPDH（1 ∶5000）、RIP1（1 ∶1000）、RIP3（1 ∶1000）、MLKL（1 ∶1000） 和TNF-α（1 ∶1000），4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，TBST 洗膜3 次后用ECL试 剂 显 影 曝 光。TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 以GAPDH 蛋白条带作为参照，通过Bio-Rad 凝胶成像系统扫描，ImageLab 图像软件定量分析每个条带灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni 校正的t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 探究含不同浓度葡萄糖的DMEM 高糖培养基对NRK52E 活性的影响 MTS 实验结果表明，给予含低浓度葡萄糖的DMEM 高糖培养基处理后，NRK52E 的活性无明显改变，随着培养基中葡萄糖浓度的增加，细胞活性逐渐降低。在给予含30、60mmol/L 葡萄糖的DMEM 高糖培养基处理后，NRK52E 活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1）。因此，在本研究通过给予含30mmol/L 葡萄糖的DMEM 高糖培养基处理NRK52E 构建糖尿病肾病细胞模型。

图1 不同浓度葡萄糖处理对于肾小管上皮细胞活性的影响

2.2 高糖培养基可诱导NRK52E 坏死和凋亡改变 为了探究高糖培养基对NRK52E 的损伤作用，本研究通过凋亡和坏死染色试剂盒对细胞进行染色。荧光染色结果表明正常对照组细胞无明显异常（弱红色与弱蓝色荧光）；而给予高糖处理后，NRK52E 出现大量细胞凋亡（弱红色荧光、强蓝色荧光）及坏死（强红色荧光、强蓝色荧光）。

2.3 高糖培养基可诱导NRK52E 程序性坏死相关蛋白表达水平的上调 Western blot 检测结果表明，与正常对照组比较，给予高糖培养基处理后NRK52E 内程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表达水平显著上调（P＜0.05，见图2）。

2.4 高糖培养基可诱导NRK52E 上清液中及细胞内TNF-α 蛋白表达水平的上调 ELISA 实验结果表明，与正常对照组比较，给予高糖培养基处理后NRK52E上清液中TNF-α 表达水平显著上调（P＜0.05，见图3）；western blot 检测结果表明，与正常对照组比较，给予高糖培养基处理后NRK52E 内TNF-α 蛋白表达水平显著上调（P＜0.05，见图3）。

图2 高糖培养基对于肾小管上皮细胞程序性坏死蛋白RIPI、RIP3和MLKL表达水平的影响

图3 高糖培养基对于细胞上清液和肾小管上皮细胞内TNF-α蛋白表达水平的影响

2.5 TNF-α 抑制剂处理可下调高糖培养基诱导的NRK52E 程序性坏死 Western blot 检测结果表明，与糖尿病肾病组比较，给予TNF-α 抑制剂处理可显著抑制高糖培养基诱导的NRK52E 内程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表达水平的上调（P＜0.05，见图4）。

图5 TNF-α抑制剂对于肾小管上皮细胞内RIPI、RIP3和MLKL蛋白表达水平的影响

3 讨论

糖尿病肾病是一种常见的糖尿病并发症，其主要特征为肾小球肥大和细胞外基质堆积，进而导致肾小球纤维化，最终引起肾功能不全［4］。本研究通过体外实验构建糖尿病肾病细胞模型从而明确糖尿病肾病的疾病过程，结果表明TNF-α 诱导的程序性坏死在糖尿病肾病的疾病过程中发挥重要的调控作用。

已有大量研究结果表明，程序性坏死在不同疾病过程中发挥重要调控作用，Jun 等［5］的研究表明，程序性坏死可作为脑中风新的治疗靶点。Wang 等［6］的研究表明，通过药物抑制程序性坏死进程可以有效治疗脊髓损伤。Coornaert 等［7］的研究表明，通过抑制程序性坏死可以有效延缓动脉粥样硬化的形成。程序性坏死这种新的死亡模式需要受体相互作用蛋白激酶RIP1、RIP3 和MLKL 的参与，两者通过结合区相互结合形成诱导死亡信号复合体，从而促进细胞程序性坏死。本实验通过检测NRK52E 内程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表达水平，从而明确NRK52E 程序性坏死严重程度。该研究结果表明程序性坏死在糖尿病肾病的演变过程中发挥重要的调控作用。

有研究表明TNF-α 可通过作用于TNFR 受体激活细胞内程序性坏死过程［8］。在本实验中，作者通过多种生物学实验检测细胞上清液中和细胞内TNF-α 表达水平，结果表明TNF-α 表达水平显著上调。在给予高糖培养基处理的NRK52ETNF-α 抑制剂处理后，细胞内程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表达水平显著降低。这一实验结果表明TNF-α 在高糖诱导的NRK52E 程序性坏死过程中发挥重要的调控作用。

综上所述，本研究发现在给予NRK52E 高糖培养基处理后，细胞上清液中和细胞内炎症因子TNF-α表达水平以及细胞内程序性坏死相关蛋白表达水平显著上调。在给予NRK52ETNF-α 抑制剂处理后细胞内程序性坏死相关蛋白表达水平显著下调。结果表明TNF-α 可通过调控NRK52E 程序性坏死过程促进高糖诱导的NRK52E 损伤，本研究结果为糖尿病肾病治疗新的靶点提供了理论依据。