miR-22-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响及其机制研究

李巍 冯胜华 赵景明

骨关节炎是临床常见的一种疾病，软骨细胞凋亡率升高是骨关节炎发生的重要原因［1-3］。miR-22-3p 在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的内皮细胞损伤中表达下调，上调miR-22-3p 表达可保护ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤［4］。通过生物学信息分析显示TRIM8 可能是miR-22-3p 的靶基因，TRIM8 在缺血再灌注脑损伤中上调表达，沉默其表达可减轻缺血再灌注诱导的脑损伤［5］。但miR-22-3p 是否可靶向TRIM8 从而影响软骨细胞损伤尚未可知。既往研究显示IL-1β 属于促炎因子并可促进软骨细胞凋亡从而促进骨关节炎的发展［6］。因此，本研究采用IL-1β 处理软骨细胞构建骨关节炎模型，观察miR-22-3p 与TRIM8 的表达变化，探讨miR-22-3p 对IL-1β 诱导软骨细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9 只SD 大鼠，SPF 级，购自南京君科生物工程有限公司，动物许可证号SCXK（宁）：2016-0003。IL-1β 购自美国Sigma 公司；miR-22-3p mimics、miR-NC、si-TRIM8、si-NC、anti-miR-22-3p、anti-miRNC 购自上海吉玛制药技术有限公司；pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司；IL-6、IFN-γ、TNF-α ELISA 检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen公司；Trizol 试剂购自上海联迈生物工程有限公司；反转录试剂盒与荧光定量PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；细胞凋亡试剂盒购自北京博尔迈生物技术有限公司；荧光素酶报告基因载体购自南京中洪博元生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司；兔抗鼠TRIM8 抗体购自美国Abcam 公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax 抗体购自美国CST 公司；RIPA 裂解液与BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 软骨细胞分离培养及实验分组

软骨细胞分离及培养方法［7-8］。同时将正常培养的细胞作为Con 组。分别将miR-NC、miR-22-3p mimics、si-NC、si-TRIM8、miR-22-3p mimics 与pcDNA、miR-22-3p mimics 与pcDNA-TRIM8 转染至软骨细胞，加入浓度为10 ng/mL IL-1β 处理48 h，分别记作IL-1β+miR-NC 组、IL-1β+miR-22-3p 组、IL-1β+si-NC 组、IL-1β+si-TRIM8 组、IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 组、IL-1β+miR-22-3p+pcDNATRIM8 组。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-22-3p、TRIM8 mRNA 的表达水平

采用Trizol 法提取细胞总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA 浓度。按照反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录为cDNA。qRT-PCR 反应体系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 补足体系至20 μL；反应条件：95℃2 min，95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s（循环40 次）。miR-22-3p 以U6 为内参，TRIM8 以GAPDH 为 内 参，采 用2-ΔΔCt法 计 算miR-22-3p、TRIM8 mRNA 的表达水平。

1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-6、IFN-γ、TNF-α 含量

收集各组细胞培养上清液，检测IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集各组细胞，预冷PBS 清洗，4℃条件下经1 000 r/min 离心10 min，加入500 μL Binding Buffer 悬浮细胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC，充分混匀，加入5 μL PI，充分混匀，室温避光孵育10 min，利用流式细胞仪检测各组软骨细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-22-3p 的靶基因

StarBase 预测显示miR-22-3p 与miR-149-5p 存在靶向关系，构建野生型载体WT-TRIM8、突变型载体MUT-TRIM8，取对数生长期软骨细胞，分别将miR-NC、miR-22-3p mimics 与WT-TRIM8、MUTTRIM8 共转染至软骨细胞，检测各组荧光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测TRIM8、Bcl-2、Bax 蛋白表达

收集各组细胞，加入RIPA 蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，SDS-PAGE 分离蛋白，反应结束后转膜、封闭，加入TRIM8（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）一抗稀释液，4℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入二抗稀释液（1∶2 000），暗室内曝光显影，置于自动凝胶成像系统分析各蛋白条带。

1.3 统计学处理

应用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料均符合正态分布，以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 诱导软骨细胞损伤中的表达

与Con 组比较，IL-1β 组细胞中miR-22-3p 的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），TRIM8 mRNA 及蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 诱导软骨细胞损伤中的表达（±s）Table 1 Expression of miR-22-3p and TRIM8 in IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 诱导软骨细胞损伤中的表达（±s）Table 1 Expression of miR-22-3p and TRIM8 in IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

分组Con IL-1β t 值P 值n99 miR-22-3p 1.00±0.06 0.41±0.05 22.663 0.000 TRIM8 mRNA 0.99±0.05 3.11±0.29 21.612 0.000 TRIM8 蛋白0.39±0.04 0.78±0.07 14.512 0.000

2.2 miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响

与Con组比较，IL-1β组细胞IL-6、IFN-γ、TNF-α水平、细胞凋亡率及Bax 蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），与IL-1β+miR-NC 组比较，IL-1β+miR-22-3p 组细胞IL-6、IFN-γ、TNF-α水平、Bax 蛋白水平、细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3 抑制TRIM8 表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响

与IL-1β+si-NC 组比较，IL-1β+si-TRIM8 组细胞IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著升高（P＜0.05），Bax 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见表3。

表2 miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响（±s）Table 2 The effect of miR-22-3p overexpression on chondrocyte injury induced by IL-1β（±s）

表2 miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响（±s）Table 2 The effect of miR-22-3p overexpression on chondrocyte injury induced by IL-1β（±s）

注：与Con 组比较，aP＜0.05；与IL-1β+miR-NC 组比较，bP＜0.05。

分组Con IL-1β IL-1β+miR-NC IL-1β+miR-22-3p F 值P 值n9999 miR-22-3p 1.01±0.06 0.46±0.04a 0.44±0.04 0.82±0.08b 213.159 0.000 IL-6（ng/L）2.45±0.25 7.55±0.71a 7.61±0.72 3.56±0.35b 214.146 0.000 IFN-γ（ng/L）11.54±1.12 62.33±6.14a 64.28±6.32 17.25±1.54b 355.917 0.000 TNF-α（ng/L）7.22±0.71 31.65±3.11a 33.27±3.35 10.87±1.01b 297.734 0.000凋亡率（%）6.32±0.61 24.13±2.11a 25.36±2.32 11.25±1.14b 279.116 0.000 Bcl-2 蛋白0.73±0.07 0.30±0.03a 0.28±0.03 0.64±0.05b 209.054 0.000 Bax 蛋白0.22±0.03 0.63±0.06a 0.65±0.05 0.33±0.03b 211.861 0.000

表3 抑制TRIM8 表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响（±s）Table 3 The effect of inhibiting TRIM8 expression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表3 抑制TRIM8 表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的影响（±s）Table 3 The effect of inhibiting TRIM8 expression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

注：与Con 组比较，aP＜0.05；与IL-1β+si-NC 组比较，bP＜0.05。

分组Con IL-1β IL-1β+si-NC IL-1β+si-TRIM8 F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.36±0.03 0.77±0.07a 0.79±0.08 0.43±0.04b 131.196 0.000 IL-6（ng/L）2.67±0.26 7.84±0.77a 7.91±0.76 3.86±0.38b 190.634 0.000 IFN-γ（ng/L）10.32±1.04 61.39±6.11a 63.54±6.21 24.15±2.44b 220.852 0.000 TNF-α（ng/L）7.01±0.69 32.45±3.22a 34.67±3.41 15.28±1.52b 261.030 0.000凋亡率（%）7.36±0.71 23.66±2.31a 24.87±2.43 13.58±1.36b 185.700 0.000 Bcl-2 蛋白0.72±0.06 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.59±0.05b 198.987 0.000 Bax 蛋白0.21±0.03 0.62±0.06a 0.63±0.06 0.39±0.04b 150.773 0.000

2.4 miR-22-3p 靶向调控TRIM8 的表达

StarBase 预测显示TRIM8 的3′UTR 中含有与miR-22-3p 互补的核苷酸序列，见图1。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型载体WTTRIM8 的细胞实验中，与miR-NC 组比较，miR-22-3p 组荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；共转染突变型载体MUT-TRIM8 的细胞实验中，miR-22-3p组荧光素酶活性与miR-NC 组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。与miR-NC 组比较，miR-22-3p 组细胞中TRIM8 蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-22-3p 组细胞中TRIM8 蛋白水平显著升高（P＜0.05）。见表5。

表4 双荧光素酶报告实验检测miR-22-3p 与TRIM8 的靶向关系（±s）Table 4 Dual-luciferase reporting assay was used to detect the targeted relationship between Mir-22-3p and TRIM8（±s）

表4 双荧光素酶报告实验检测miR-22-3p 与TRIM8 的靶向关系（±s）Table 4 Dual-luciferase reporting assay was used to detect the targeted relationship between Mir-22-3p and TRIM8（±s）

注：与miR-NC 组比较，aP＜0.05。

分组miR-NC miR-22-3p t 值P 值n99 WT-TRIM8 1.02±0.06 0.48±0.04a 22.465 0.000 MUT-TRIM8 0.99±0.05 1.00±0.05 0.424 0.677

2.5 TRIM8 过表达逆转了miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的作用

与IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 组比较，IL-1β+miR-22-3p+pcDNA-TRIM8 组细胞IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平显著升高（P＜0.05）。见表6。

表5 敲除或过表达miR-22-3p 对TRIM8 蛋白表达的影响（±s）Table 5 Effect of knockout or overexpression of miR-22-3p on TRIM8 protein expression（±s）

表5 敲除或过表达miR-22-3p 对TRIM8 蛋白表达的影响（±s）Table 5 Effect of knockout or overexpression of miR-22-3p on TRIM8 protein expression（±s）

注：与miR-NC 组比较，aP＜0.05；与anti-miR-NC 组比较，bP＜0.05。

分组miR-NC miR-22-3p anti-miR-NC anti-miR-22-3p F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.41±0.04 0.20±0.02a 0.38±0.03 0.83±0.07b 328.154 0.000

3 讨论

miR-22-3p 在视网膜病变中表达降低，抑制视网膜色素上皮细胞损伤［9］。miR-22-3p 过表达可减轻阿尔茨海默症细胞模型损伤［10］。miR-22-3p 可减轻牙周膜干细胞炎症反应并可调控细胞分化［11］。本研究结果提示miR-22-3p 表达量降低可能促进细胞损伤的发生。为探究miR-22-3p 在软骨细胞损伤中的作用机制，已有报道指出IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平升高可加重炎症反应从而促进多种疾病发生［12］。本研究结果提示miR-22-3p 过表达可减轻IL-1β 诱导的软骨细胞炎症损伤。同时本研究结果显示IL-1β 处理后软骨细胞凋亡率显著增加，而miR-22-3p 过表达后软骨细胞凋亡率显著降低，提示miR-22-3p 过表达可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡。为进一步验证其可能调控机制，本研究检测抗细胞凋亡蛋白Bcl-2 和促细胞凋亡蛋白Bax 的表达。已有研究表明当细胞接收凋亡信号时，Bcl-2 表达下调，Bax 表达上调，并可激活caspase 联级反应从而诱导细胞凋亡［13］。本研究结果显示IL-1β 处理后软骨细胞中Bcl-2 表达下调，Bax 表达上调，而miR-22-3p 过表达后软骨细胞中Bcl-2 表达上调，Bax 表达下调，提示miR-22-3p过表达可能通过调控Bcl-2、Bax 蛋白表达从而抑制软骨细胞凋亡。

表6 TRIM8 过表达逆转了miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的作用（±s）Table 6 TRIM8 overexpression reverses the effect of miR-22-3p overexpression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表6 TRIM8 过表达逆转了miR-22-3p 过表达对IL-1β 诱导软骨细胞损伤的作用（±s）Table 6 TRIM8 overexpression reverses the effect of miR-22-3p overexpression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

注：与IL-1β+miR-NC 组比较，aP＜0.05；与IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 组比较，bP＜0.05。

分组IL-1β+miR-NC IL-1β+miR-22-3p IL-1β+miR-22-3p+pcDNA IL-1β+miR-22-3p+pcDNA-TRIM8 F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.76±0.07 0.33±0.03a 0.32±0.03 0.65±0.06b 175.340 0.000 IL-6（ng/L）7.71±0.69 3.42±0.34a 3.40±0.33 7.12±0.71b 161.510 0.000 IFN-γ（ng/L）63.54±6.33 16.47±1.65a 16.24±1.62 52.13±5.21b 295.322 0.000 TNF-α（ng/L）32.48±3.22 11.25±1.13a 10.52±1.06 26.33±2.61b 234.315 0.000凋亡率（%）26.14±2.63 12.36±1.23a 11.47±1.15 20.33±2.13b 122.120 0.000 Bcl-2 蛋白0.29±0.03 0.66±0.05a 0.67±0.04 0.41±0.04b 193.591 0.000 Bax 蛋白0.64±0.06 0.31±0.03a 0.29±0.03 0.53±0.05b 132.873 0.000

TRIM8 在OGD/R 诱导的神经元细胞损伤中表达上调，敲低其表达可升高OGD/R 诱导的神经元细胞活性，降低细胞凋亡，减少ROS 的产生［14］。TRIM8 在肝缺血再灌注损伤小鼠模型中高表达，沉默其表达可抑制缺血再灌注诱导的肝炎症损伤和细胞凋亡［15］。本研究结果显示IL-1β 处理后软骨细胞中TRIM8 的表达量显著升高，进一步研究显示抑制TRIM8 表达后可显著降低IL-1β 诱导软骨细胞中IL-6、IFN-γ、TNF-α 的水平，并可降低软骨细胞凋亡率，还可促进Bcl-2 表达及抑制Bax 表达，提示抑制TRIM8 表达可减轻IL-1β 诱导软骨细胞损伤。本研究通过双荧光素酶报告实验与Western blot 实验证实miR-22-3p 可靶向结合TRIM8，并可负向调控TRIM8 的表达及活性，为探究miR-22-3p 是否可通过靶向TRIM8 从而参与软骨细胞损伤过程，本研究将pcDNA-TRIM8 与miR-22-3p mimics 共转染至软骨细胞，随后使用IL-1β 处理，结果显示IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平显著升高，细胞凋亡率显著升高，Bcl-2 蛋白水平显著降低，Bax 蛋白水平显著升高，提示miR-22-3p 过表达可能通过下调TRIM8 表达而降低炎症反应及抑制软骨细胞凋亡。

综上所述，IL-1β 诱导的软骨细胞中miR-22-3p的表达下调，TRIM8 的表达上调，miR-22-3p 过表达可能通过调控TRIM8 表达从而减轻IL-1β 诱导的软骨细胞炎症损伤，并可抑制软骨细胞凋亡，可为骨关节炎的治疗提供理论依据。