基因编辑及其在疾病治疗中的应用研究进展

华亮 朱冰

DNA 双螺旋结构的提出，开启了现代分子生物学的时代。从此，人类对疾病尤其是遗传性疾病的认识进入了DNA 分子层面。随着基因测序技术的不断发展，越来越多的疾病的分子机理被发现。2015年美国总统奥巴马提出“精准医疗”的概念，通过修改或编辑基因序列的方式进行个体化疾病治疗越来越成为研究和关注的热点。

1 基因编辑的原理

基因编辑技术的基本原理大致相同：通过人工核酸内切酶，精确靶向特异性切割DNA 双链诱导形成位点特异性的DNA 双链断裂（doublestrand break，DSB），DSB 产生后，激活细胞启动两种主要的天然修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HRR）。通常，细胞主要通过NHEJ 方式进行修复，NHEJ 在断裂DNA 修复重连的过程中，能够在DSB 位点产生碱基随机插入或缺失（indel），常造成移码突变使基因失活，从而实现目的基因的敲除。若一个外源性供体基因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的外源基因敲入。当一个带有同源臂的重组供体存在时，细胞还会采取HDR 的方式对DSB 进行修复，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，从而实现特定位点的精确插入、缺失或者碱基置换，而不会出现随机的碱基插入或丢失。

2 基因编辑的简要发展历程

1986年，Smithies 等［1］提出同源重组能够被应用于人类疾病的治疗，标志着基因组编辑时代的开启。同年，Kirk R 等［2］用核内注射的方法对哺乳动物细胞内染色体上由突变造成的基因缺陷进行修复时首次提出基因编辑的概念。

借助不同的核酸内切酶平台，研究人员能够在靶基因组中制造位点特异性的DNA 断裂点。伴随着用于基因编辑的人工核酸内切酶平台的发展，其介导的基因编辑技术也历经了多个阶段的变革。

2.1 大范围核酸酶技术

大范围核酸酶是一种具有较大切割位点（12～45 bp）的序列特异性核酸内切酶。研究者将其用于细胞系诱导靶序列附近产生DSB，以达到在基因组中敲除内源基因或敲入外源基因的目的，或矫正与单基因疾病相关的突变。它的编辑精度高，自身编码基因较小，易包装入AAV 载体中。但是，由于其种类限制，以及大部分大范围核酸酶很难在人基因组上找到合适的位点，使其广泛应用受到限制。

2.2 锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）技术

ZFP 是一类通过Cys2-His2 锌指结构域结合DNA 的转录因子。ZFN 主要包括用于识别和结合特定DNA 序列重复的ZFP 和可以通过二聚体化非特异地切割DNA 的核酸内切酶Fok I。利用一对串联的锌指结合特异DNA，将Fok I 的两个亚基带到特定基因组位点，对DNA 进行切割产生DSB。该技术靶向结合效率高，但是其识别特定DNA 的锌指序列需要通过文库筛选来确定，锌指核酸酶存在上下游DNA 序列的依赖效应，进一步加大了筛选的难度，无法实现对任意靶基因的结合，亦无法实现高通量的基因编辑。且可能产生脱靶效应，引发细胞毒性，对其推广运用造成了一定的影响。

2.3 转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术

与ZFN 相似，TALEN 也由两部分构成，一部分是由33-35 个氨基酸的重复单元组成，通过位于12 位和13 位的两个可变氨基酸残基识别并结合DNA 序列，其唯一靶向限制是对N 端结构有5′T的要求，所以，理论上可以通过构建不同的位于12位和13 位的两个可变氨基酸残基达到靶向几乎任何DNA 序列的目的。另一部分是与ZFN 相同的限制性核酸内切酶Fok I。TALEN 技术在一定程度上克服了ZFN 技术存在的脱靶问题，设计简单，特异性和活性更高。目前，已在人类多功能干细胞和体细胞中有效诱导NHEJ 和HDR。但是，TALEN 的体积比ZFN 大，使得某些病毒传递系统的包装较困难，从而限制了其用于高通量的基因编辑。

2.4 成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）技术

CRISPR/Cas9 技术通过sgRNA 与靶标DNA中相对保守的PAM 序列的上游基因互补配对，再经Cas9 蛋白对靶标基因进行切割。通过设计与目标片段匹配的sgRNA，就可以精确地定位到所有的DNA 位置，然后由Cas9 剪切DNA 形成DBS。为了避免NHEJ 出现基因变异，可使用外源DNA模板进行HDR，对靶标基因进行修饰，从而实现精准基因编辑。且CRISPR 系统可以同时靶向多个基因，这对研究复杂的人类疾病上是一个巨大的进步。与ZFN 和TALEN 相比，CRISPR/Cas9 设计简便、成本低、效率高，可用于高通量的基因编辑。然而，CRISPR/Cas9 系统也有其不足之处，主要体现在功能发挥时系统对DNA 上PAM 序列的依赖性以及切割时潜在的脱靶效应。在CRISPR/Cas9系统中，Cas9 只在具有PAM 序列且可以与sgRNA 互补配对的靶序列发生切割。基于这些需要改善的方面，研究人员开创性地发现了一些识别更多样PAM 的CRISPR/Cas 系统，这些优化或改造的Cas9 可降低50～1 500 倍的脱靶率，极大地解决了脱靶问题。

2.5 单碱基编辑（Base editor，BE）技术

2016年，哈佛大学的David Liu 实验室报道了一种基于脱氨酶与CRISPR/Cas9 系统融合形成的BE 技术［3］：由sgRNA 和经过改造的Cas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子组成的复合体。胞嘧啶脱氨酶可将胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶，在DNA 复制过程中则变为胸腺嘧啶。BE 技术不引入DSB，不需要重组修复模板，且效率远高于由DSB 引起的同源重组修复，对许多点突变造成的疾病具有很大的应用潜能。

2.6 表观基因组编辑和转录调控

表观遗传修饰和转录调控是把各种表观调控效应器融合到工程化缺陷型核酸酶（dCas9）上，利用dCas9 靶向识别并结合DNA 的特性，实现在特定位点上表观基因组的编辑。这些调控效应器同dCas9 的结合拓展了CRISPR 在转录调控和表观基因组编辑的应用范围，且dCas9 的表观基因组编辑具有很高的安全性和特异性，无明显的脱靶效应，为体内表观基因修饰和治疗奠定了基础。

3 基因编辑在疾病治疗中的应用

基因编辑治疗人类疾病在体内和体外都取得了成功。体内基因治疗包括组织特异性靶向，局部递送或靶细胞特异性基因表达；而离体疗法靶向体外的细胞，这些修饰的细胞可用于疾病建模或用作治疗剂。

3.1 体外基因编辑

体外基因编辑是从病人身上提取相应的细胞，在基因编辑后将细胞移植回患者相应部位以达到治疗疾病的目的的治疗方法。该技术最大的优点在于它消除了捐赠者组织与移植者之间的免疫排斥。将所需基因转移到造血干细胞，然后移植给患者已经改善甚至治疗了血液系统和免疫系统的单基因病。如：X 连锁严重的联合免疫缺陷、腺苷脱氨酶、严重的联合免疫缺陷、肾上腺脑白质营养不良、异染性白质营养不良、Wiskott-Aldrich综合征和β-地中海贫血［4-5］。

通过基因编辑和NHEJ 对目的基因进行插入或敲除操作研究已经应用于包括镰状细胞病和地中海贫血在内的血红蛋白病［6］。使用HRR 进行基因编辑也显示出巨大潜力。如在影响造血系统的遗传缺陷中，已经发现了许多疾病，包括溶酶体酶缺乏症［7］，地中海贫血［8］，慢性肉芽肿病［9］和X 连锁高IgM 综合征［10］。

3.2 体内基因编辑

当受影响的细胞或组织无法从患者身上获得，或者离体操作后无法有效地移植回患者体内，则必须进行体内基因编辑。

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是基因突变引起的，导致骨骼肌和心肌进行性变性。利用AAV 载体将Cas9 和sgRNAs递送到DMD 小鼠体内，能够使DMD 基因外显子缺失，靶细胞再通过NHEJ 对目的基因进行修复，从而部分恢复阅读框，使骨骼肌和心肌的生化和功能改善［11-12］。

利用AAV 载体结合NHEJ 的基因编辑方法被用于中枢神经系统的遗传病。学者们将所需成分直接注射到患者视网膜或大脑中治疗这些疾病。如亨廷顿舞蹈症［13］，常染色体显性遗传性视网膜色素变性［14］，以及莱伯先天性黑蒙症10［15］。

对于需要基因较正或基因替代进行治疗的疾病，其治疗方式是使患者体内获得足够的体内HRR。这种方法已被用于治疗一些肝脏代谢性疾病：鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症［16］、乙型血友病［17］、黏多糖贮积症Ⅰ、黏多糖贮积症Ⅱ、法布雷病和戈谢病［18-19］。学者们还通过敲除同一代谢途径中的基因，将Ⅰ型酪氨酸血症转变为更良性的Ⅲ型酪氨酸血症［20］。

3.3 病毒性疾病的基因编辑

基因编辑同样被用于病毒性疾病。研究人员通过gRNA 和用AAVs 转染的Cas9 成功去除了HIV 转基因小鼠中跨LTR 和gag 区的病毒DNA 基因组［21］。一项针对病毒逃逸和突变的单独研究表明，靶向HIV 基因组两个不同区域的两个强gRNA可以完全阻止病毒复制［22］。

乙型肝炎具有共价闭合的环状DNA（cccDNA），其在肝脏中处于休眠状态，且cccDNA 充当慢性感染和再激活转录的模板，因此抗病毒药无法成功消除该病毒。研究人员通过HBV 靶向gRNA，并利用Cas9 切割cccDNA，造成多个缺失和突变，随后通过宿主的NHEJ 机制对其进行了修复。结果显示可以将HBV 感染减少多达八倍［23］。

3.4 表观遗传学疾病的基因编辑

表观遗传修饰的失调与多种人类疾病有关，基因编辑技术的应用为表观遗传机制异常疾病的研究和治疗创造了一种全新的方法。如，在自然界中，表观遗传沉默可以导致靶基因表达在多个有丝分裂过程中完全减弱。通过靶向组蛋白和DNA 甲基转移酶的不同组合在不同的位点实现对靶基因最大程度的抑制［24］。基于神经元优化的CRISPR 系统能够在多个主要啮齿动物神经元培养系统上实现强大，模块化和可调的基因诱导以及多重基因调控［25］。研究证明，Cas9 系统在体内可以通过反表观遗传重塑激活内源性靶基因［26］，并被用于糖尿病，肌肉营养不良和急性肾脏疾病的小鼠模型中。此外，CRISPR-Cas9 还被用于体内小鼠视网膜色素变性模型中，通过使Nrl（棒状光感受器的主要调节基因）失活而将棒状光感细胞重编程为圆锥状细胞，证明CRISPR-Cas9 可通过转录抑制防止视力丧失［27］。

4 结语与展望

在过去的十年中，基因编辑取得了长足的进步。特别是2013年后，随着CRISPR/Cas9 系统的开发，我们取得了更大的进步。借助这些工具，我们已经拥有了一类全新的疗法来治疗甚至治愈以前缺乏有效干预措施的疾病。基因编辑技术将被应用于生物医学的许多领域并将彻底改变这些领域。虽然，目前这一技术还需要加以完善。但是，我们相信：一旦该技术变得更普及，无疑将使患者受益。而这些技术肯定会得到进一步完善，并在未来的某一天可能会成为许多疾病的主流疗法。