离子色谱-电感耦合等离子体质谱法测定香菇中5种硒形态

赵 彤 ,周慧敏 ,冮 洁

(1.大连市食品检验检测院,大连 116630; 2.大连民族大学,大连 116600)

硒是人体必需的微量元素之一[1],具有清除体内自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能[2]。硒摄入不足可以引起心血管疾病、肿瘤、大骨节病、关节炎等[3],补硒可以预防相关疾病的发生。但无机硒毒性较大[4],日本、美国等发达国家早已禁止在食品中添加亚硒酸钠等无机硒[5]。因此,仅测定硒总量已不能满足该元素在生物体系中生理、毒理作用研究的需要,研究其形态对其品质评价具有更加重要的意义。

富硒香菇属于功能性农产品,是富含硒的食物,具有特殊的营养价值,在全国多个区域有广泛种植,富硒香菇中的硒富集主要来自培养基中的可溶性硒盐,可溶性硒盐通过植物根部被吸收,进入内循环系统的路径,参与了蛋白质的合成,将无机硒转换为有机硒,更适合人体吸收和利用。

测定硒的国家标准主要有GB 5009.93－2017《食品中硒的测定》、GB 1903.22－2016《食品安全国家标准 食品营养强化剂 富硒食用菌粉》。GB 5009.93－2017是对食品中总硒进行测定,不能对硒的形态进行测定,从而不能正确了解和评价香菇中硒的形态分布,以及对人体健康的作用;GB 1903.22－2016采用水磁力搅拌的方式提取样品,无法有效提取样品中多种形态的硒。目前尚无测定食品中硒形态的国家标准。本工作以蛋白酶E 和柠檬酸溶液为提取剂,采用恒温水浴振荡和超声提取法作为前处理,香菇样品溶液经离子色谱(IC)分离后,采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行测定,方法简单快速,可以同时测定香菇中亚硒酸根、硒酸根这2种无机硒和硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸等3种有机硒的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Aglient 7800型电感耦合等离子体质谱仪;Agilent 1260型液相色谱仪。

亚硒酸根[Se(Ⅳ)]、硒酸根[Se(Ⅵ)]标准储备溶液:1 000 mg·L－1(以硒计)。

硒代蛋氨酸(Se Met)标准储备溶液:5.0 mg·L－1(以硒计),称取适量的硒代蛋氨酸标准品用水溶解,溶解过程中滴加2～3滴盐酸。

甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代胱氨酸(SeCys2)标准储备溶液:5.0 mg·L－1(以硒计),分别称取适量的甲基硒代半胱氨酸标准品和硒代胱氨酸标准品用水溶解。

流动相:含1% (体积分数,下同)甲醇的5 mmol·L－1柠檬酸溶液(pH 5.0),称取1.05 g柠檬酸溶于1 L 水中,用氨水调pH 至5.0,再加入10 mL甲醇,于水浴中超声脱气10 min,备用。

硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸标准品的纯度均大于99%;氨水、柠檬酸、正己烷均为分析纯;盐酸为优级纯;试验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器工作条件

1)IC条件 Hamilton PRP X100阴离子交换柱(250 mm×4 mm)[6],保护柱(50 mm×4 mm);流量1.0 mL·min－1;进样体积50μL。

2)ICP-MS条件 射频功率1 550 W;采样深度9 mm;采集质量数78;载气流量0.7 L·min－1,辅助气流量0.48 L·min－1;积分时间0.5 s。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

香菇样品来源于某富硒香菇种植试验区,通过在培养基中添加不同含量的亚硒酸盐而种植得到富硒香菇,包括对照空白样品(不富硒的样品),样品经干燥研磨成粉后备用。

1.3.2 总硒的测定

称取香菇粉末样品约0.5 g置于消解罐中,加入5 mL硝酸和2 mL 过氧化氢进行微波消解。消解完成后在电热板上赶酸至1 mL,然后转移至50 mL的容量瓶中,用水稀释至刻度,按ICP-MS条件进行测定,同时做空白试验[7]。

1.3.3 硒形态测定

称取香菇粉末样品约0.5 g于刻度离心管中,加入20 mL水混匀,按照样品与酶质量比10∶1加入蛋白酶E,混匀,置于37 ℃恒温水浴中振荡提取6 h后,加入50 mmol·L－1柠檬酸溶液2.5 mL,常温超声10 min,取出后用水定容至25.0 mL,于10 000 r·min－1转速下离心10 min。收集上清液5 mL,加入正己烷1 mL 涡旋混合,收集水相过0.22μm 水膜后,按仪器工作条件进行测定。

1.3.4 其他提取试验

称取香菇粉末样品约0.5 g于刻度离心管中,加入20 mL提取剂[提取剂分别为水、1%(体积分数,下同)硝酸溶液、1%(体积分数,下同)盐酸溶液、5 mmol·L－1柠檬酸溶液],在常温、37 ℃、60 ℃下超声10 min,取出后用水定容至25.0 mL,于10 000 r·min－1转速下离心10 min。收集上清液过0.22μm 水膜后,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件对20.0μg·L－1的5种硒形态混合标准溶液进行测定,其色谱图见图1。

2.2 流动相的选择

磷酸盐体系和柠檬酸体系是元素形态测定常用的流动相体系,采用磷酸盐体系时由于受离子效应的影响,灵敏度明显较采用柠檬酸体系时的灵敏度低。由于电感耦合等离子体质谱法对硒的响应相对比较低,灵敏度对测定至关重要,且柠檬酸为有机酸,在质谱上有明显的增敏效应,因此试验选择流动相为柠檬酸体系。

图1 5种硒形态混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 5 selenium species

试验分别配制5,10,20 mmol·L－1的柠檬酸溶液,充分溶解后用氨水调节每种浓度柠檬酸溶液的pH 依次为4.0,5.0,6.0进行试验。结果表明:柠檬酸溶液的浓度和pH 越高,分离度越差。试验选择柠檬酸溶液的浓度为5 mmol·L－1。5 mmol·L－1柠檬酸溶液的酸度对5种硒形态保留时间的影响见图2,pH 为4.0时,硒酸根未出峰。

图2 5 mmol·L－1柠檬酸溶液的酸度对5种硒形态保留时间的影响Fig.2 Effect of acidity of 5 mmol·L－1 citric acid solution on retention time of 5 selenium species

由图2可知:pH 为5.0时,5种硒形态的保留时间均较好。试验结果表明:pH 为5.0时,5种硒形态的峰形均较好。试验选择流动相为含1%甲醇的5 mmol·L－1柠檬酸溶液(pH 5.0),加入1%的甲醇可起到进一步增加灵敏度和降低柱压的效果[7]。

2.3 提取方法的选择

目前硒形态测定的前处理提取方法较多,有水提取法、酸提取法、碱提取法、有机溶剂提取法和酶提取法[8]。形态测定只有好的回收率是不够的,还要有好的提取率,很多试验采用了水作为提取剂,虽然获得了较好的回收率,但对以蛋白形态结合的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸提取率较低[7],总提取率不足30%。试验考察了提取剂依次为水、1%硝酸溶液、1%盐酸溶液、5 mmol·L－1柠檬酸溶液时在不同提取温度(常温、37 ℃、60 ℃)下对5种硒形态回收率的影响,结果见表1,超声提取时间10 min。

表1 提取剂在不同提取温度下对5种硒形态回收率的影响Tab.1 Effect of extractant on recovery of 5 selenium species at different extraction temperatures%

由表1可知:5种硒形态在5 mmol·L－1柠檬酸溶液中稳定性较好,5种硒形态的回收率均较高,其中无机硒的回收率大于76.0%,说明在超声过程中5 mmol·L－1柠檬酸溶液更有效地维持了反应液中5种硒形态的稳定。在1%硝酸溶液和1%盐酸溶液中硒代胱氨酸的回收率远小于其他硒形态的回收率,说明在超声提取的过程中酸度对硒代胱氨酸的稳定性影响较大。硒代胱氨酸中含有较容易被破坏的Se－Se键,温度与超声过程中的外力共同作用,会使其中部分硒代胱氨酸的Se－Se键发生断裂,从而改变了部分硒代胱氨酸的结构状态,因此1%硝酸溶液和1%盐酸溶液提取不适合于硒的形态测定。试验还发现:提取温度高于60 ℃时,回收率会变差,提取温度过高不利于硒的提取。试验中加入50 mmol·L－1柠檬酸溶液2.5 mL(定容后柠檬酸浓度为5 mmol·L－1)常温超声10 min。

由于香菇中硒主要以硒蛋白形态存在,仅使用5 mmol·L－1柠檬酸溶液进行提取,提取率并不是很高。因此,试验采用蛋白酶和柠檬酸溶液共同进行提取,且考察了蛋白酶依次为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶K 和蛋白酶E 时对5种硒形态总提取率的影响,结果见表2。

由表2可知:使用蛋白酶E时,5种硒形态总提取率较好。试验选择蛋白酶E和柠檬酸溶液共同进行提取,所得提取率更高,改善了单一方式提取率较低的问题。最后采用正己烷去除油性杂质,净化后也减少了色谱柱堵塞的问题。

表2 蛋白酶对5种硒形态总提取率的影响Tab.2 Effect of protease on total extraction rate of 5 selenium species

2.4 标准曲线和检出限

分别移取适量的亚硒酸根、硒酸根、硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸标准储备溶液用水稀释混合得到5.00,10.0,20.0,50.0,100.0μg·L－1的5种硒形态混合标准溶液系列。

按仪器工作条件对5种硒形态混合标准溶液系列进行测定,以5种硒形态的质量浓度为横坐标,对应的信号强度为纵坐标绘制标准曲线。5种硒形态的线性范围、线性回归方程和相关系数见表3。

由于电感耦合等离子体质谱法对硒的响应相对较低,因此检出限对方法至关重要,一般色谱的检出限是按照3～10倍的基线噪声来计算的,但往往这种检出限在实际样品分析中并不可靠。试验采用的添加法,是在对照空白样品中加入一定量的5种硒形态混合标准溶液,通过测定发现具有数理统计意义的数据后定为方法的检出限,结果见表3。

表3 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab.3 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.5 回收试验

按试验方法对空白香菇样品进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4可知:回收率为81.8%～94.6%,RSD 为2.6%～7.1%。

2.6 样品分析

按试验方法对3个富硒香菇样品进行分析,平行测定3次,结果见表5。

由表5可知:香菇对硒有明显的富集作用,硒主要以硒代蛋氨酸形态存在,同时也有少量的亚硒酸根和其他形态硒存在。结果表明:香菇能够将大部分无机硒(亚硒酸根)转化为有机硒,相比其他富硒农产品(总硒质量分数通常小于0.05 mg·kg－1),香菇对硒的富集能力和有机转化率明显较高,可见食用富硒香菇能更有效地补充硒。本方法能够将香菇中大部分硒提取出来,提取率在72.6%～76.8%之间,但仍有部分硒不能够被提取或是以其他形态存在而不能被测定。

表4 回收试验结果(n＝5)Tab.4 Results of test for recovery(n＝5)

本工作建立了离子色谱-电感耦合等离子体质谱法测定香菇中5种硒形态的分析方法,方法有较好回收率和提取率,可以在15 min内同时测定5种硒的形态。本方法的建立,为香菇中硒元素的来源、富集、转换和迁移的深入研究提供了方法依据,对正确评价香菇中硒对人体的作用有着积极的意义。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples