高效液相色谱法测定新鲜烟叶中3种多胺

黄丽佳 ,梁梦洁 ,李应郡 ,米其利 ,黄海涛 ,杨叶昆 ,杨光宇,李 晶∗

(1.昆明医科大学药学院,昆明 650504; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300222;3.云南中烟工业有限责任公司技术中心,昆明 650106)

随着烟草基因编辑工厂化育种工作的开展,抗旱抗寒等耐逆境的品种培育已提上日程[1],对产生的大量编辑素材,利用相应的代谢物进行筛选评价是一个可靠和有效的方法[2]。多胺是植物体内代谢过程中产生的一种低分子脂肪族含氮碱,具有生物活性,其作为一种重要的生长调节因子,参与适应逆境、成熟与衰老、延迟衰老等重要的生理过程[3]。多胺的测定,对于植物体逆境胁迫的响应过程和作用具有重要的研究价值和意义[4]。

近年来,多胺的测定方法得到了很大发展,主要有高效液相色谱法(HPLC)[5]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[6]、毛细管电泳-电化学发光检测法(CE-CL)[7]、毛细管电泳-质谱法(CE-MS)[8]、离子色谱法(IC)[9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10-11]、薄层色谱法(TLC)[12]、顶空固相微萃取与离子迁移谱联用(HS-SPME-IMS)[13]、生物传感器串联光学化学法[14-15]、酶联免疫法(ELISA)[16-17]等。由于CECL、CE-MS、IC、GC-MS、HS-SPME-IMS 等方法操作复杂并且仪器昂贵,而使用紫外检测器的高效液相色谱法操作简单,能够满足烟草中多胺含量测定的需求[18],可用作烟草中多胺含量测定的手段。多胺本身不具有特征光谱吸收基团,衍生化方法不仅可以引入可测定的光谱基团,提高多胺测定灵敏度,而且可以增加多胺的非极性,改善分离度[19]。常见的衍生化试剂有邻苯二醛(OPA)、丹磺酰氯、n-羟基琥珀酰亚胺酯(DMQC-Osu)、苯甲酰氯等[20-22],其中丹磺酰氯应用较为广泛[23]。

当前并无现成的测定烟草中多胺的标准可以参考执行,而烟草育种工作中植物体内多胺的测定需求迫在眉睫,本工作采用高效液相色谱法测定新鲜烟叶中腐胺、亚精胺、精胺等3种多胺的含量,拟对烟草植株中多胺的含量建立相应的测定方法,为烟草基因编辑育种的筛选和评价提供有效工具和数据支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪,配真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、二极管阵列检测器和工作站;Milli-Q50 型超纯水仪;SJIA-50FE型冷冻干燥机;FW 80型小型粉碎机。

腐胺、亚精胺、精胺等3 种多胺的标准储备溶液:1.00 g·L－1,分别称取10.0 mg腐胺、亚精胺、精胺的标准品,用适量的0.1 mol·L－1盐酸溶液溶解后转移至10 mL棕色容量瓶中,用0.1 mol·L－1盐酸溶液稀释至刻度,于4 ℃下保存。使用时,用0.4 mol·L－1高氯酸溶液稀释至所需质量浓度。

腐胺、亚精胺、精胺的纯度均大于98%;乙腈为色谱纯;乙酸铵为优级纯;其余试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),柱温30 ℃;流量1.0 mL·min－1;进样量10μL;测定波长254 nm。流动相:A 为0.01 mol·L－1乙酸铵溶液;B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～20 min时,B 由50%升至95%,保持10 min;30～31 min时,B由95%降至50%,保持9 min。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取

5个烟苗样品(B1～B5)由某烟草基因编辑育种工厂提供,为成苗期烟苗样品;3个烟叶样品(D1～D3)为正常烟叶样品,由某烟草公司技术中心提供。

取新鲜烟叶样品,经冻干机冻干,用粉碎机加工至粉末后分装备用。

取粉末样品200.0 mg置于10 mL 离心管中,加入0.4 mol·L－1高氯酸溶液5 mL 后,于超声仪中提取40 min,以10 000 r·min－1转速离心5 min,取上清液待用。

1.3.2 样品衍生化

移取1 mL上清液至15 mL 离心管中,依次加入碱性反应介质(饱和碳酸氢钠溶液,以氢氧化钠调节pH 至12.0)800μL,4 g·L－1丹磺酰氯丙酮溶液1 mL,盖塞密封。涡旋30 s后,于水浴锅中恒温40 ℃反应40 min,避光。反应完毕后,于通风橱中加入200μL氨水,涡旋混匀,静置30 min,加入乙腈2 mL 后,用水定容,涡旋1 min,以10 000 r·min－1转速离心2 min,移取上清液,过0.45μm有机相微孔滤膜至色谱瓶中,按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对3 种多胺混合标准溶液进行测定,其色谱图见图1。

图1 3种多胺混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 3 polyamines

由图1可知:3种多胺在进样后30 min内完全出峰,各色谱峰无拖尾、峰形对称完整。

2.2 样品衍生化条件的选择

试验采用正交试验,考察了衍生化反应介质的酸度、衍生化反应时间和衍生化反应温度等3个因素对3种多胺测定结果的影响。每个因素选取3个考察水平,正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

正交试验以固定含量的腐胺、亚精胺和精胺的峰面积为优选因子,正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

表2 (续)

由表2可知:对3种多胺测定结果影响最大的因素是衍生化反应温度,其次为衍生化反应时间,最后为衍生化反应介质p H;通过优化,得出的较优方案为A3B2C1。由于A3,C1为边界点,试验还对优化试验进行了扩展,对A,C两项进行了更多点的考察,根据所有试验结果,最终仍选择A3B2C1的试验方案,该方案在各组试验中均表现为较佳或者最佳。因此,试验选择的衍生化条件为:衍生化反应温度为40 ℃,衍生化反应时间为40 min,衍生化反应介质的酸度为pH 12.0。

2.3 色谱条件的选择

多胺是一种含有多个氨基的胺类化合物,极性较强,采用丹磺酰氯衍生化后,可弱化其极性。为了获得更好的分离效果,通过改变流动相中水相比例或增加色谱柱长度来增强保留作用,可选用填料为十八烷基硅烷的色谱柱进行分离。试验参考文献[24]选用ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm)分离3种多胺。

腐胺、亚精胺和精胺的分离采用梯度洗脱,试验比较了水-乙腈、乙酸铵-乙腈两种体系的流动相,发现乙酸铵-乙腈体系作为流动相时,3种多胺的峰形尖锐、基线平稳,有利于3种多胺的分离和测定。试验对比了乙腈和甲醇作为流动相的有机相时对3种多胺测定的影响。结果表明:乙腈作为流动相的有机相时,色谱图中基线更为平稳,柱压相对较低。试验选择流动相为乙酸铵-乙腈体系。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按色谱条件对0.50,1.00,5.00,10.0,20.0,50.0 mg·L－1的3 种多胺混合标准溶液系列进行测定,以3种多胺的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:3种多胺的质量浓度均在0.50～50.0 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表3。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

由表3可知:检出限为0.07～0.08 mg·L－1,测定下限为0.23～0.28 mg·L－1。

2.5 精密度和回收试验

按试验方法对新鲜烟叶样品进行分析,并进行加标回收试验,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4可知:回收率为86.4%～100%,RSD 为0.70%～4.4%。本方法测定新鲜烟叶中腐胺、亚精胺和精胺的准确度和精密度满足分析要求。

2.6 样品分析

按试验方法对编辑素材成苗期烟苗样品和正常烟叶样品进行分析,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samplesμg·g－1

由表5可知:B1～B5的编辑素材成苗期烟苗样品主要用于耐寒、耐旱品种的选育,相较于正常烟叶样品(D1～D3)来说,腐胺在编辑素材成苗期烟苗样品中有一个明显的大幅度的提升(部分达到20倍以上),亚精胺的变化幅度不是特别明显,精胺也存在一个明显的升高的趋势。这在一定程度上表明:多胺在烟叶逆境胁迫的响应过程中具有一定的表征意义,可以作为耐寒、耐旱等逆境胁迫品种选育的一个数据支持,但是具体的影响因素和作用机理还需要后续的深入研究。

某编辑素材成苗期烟苗样品的色谱图见图2。

图2 样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of the sample

本工作建立了高效液相色谱法测定新鲜烟叶中腐胺、亚精胺及精胺等3种多胺的分析方法,本方法操作简单、色谱分离度好、精密度与回收率均满足测定要求。本方法表明:高效液相色谱法可用于新鲜烟叶中多胺的含量测定与监测,可为逆境胁迫烟叶中多胺的测定提供可靠的分析方法。