气相色谱-质谱法同时测定卷烟主流烟气中15种酚类成分

宋凌勇 ,赵 琪 ,黄世杰 ,胡 超 ,周 芸 ,李瑞丽 ,徐石磊∗

(1.广西中烟工业有限责任公司,南宁 530001; 2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,郑州 450001)

美拉德反应是指氨基化合物和羰基化合物发生的一系列复杂反应[1-2],其产物即美拉德反应产物(MRPs)作为天然香料,加入卷烟中可形成对烟草香味有重要影响的吡嗪、吡咯类和吡喃酮类化合物,可以增强烟草香气,在一定程度上解决了烟草减害增香之间的矛盾,同时具有一定的抗氧化活性和清除自由基的效果。因此,以美拉德反应为基础的烟用原料开发正成为烟草行业的研究热点[3-5]。

卷烟烟气中酚类物质主要来源于烟叶中多酚类化合物的裂解,其对卷烟香气质量具有重要影响,如2,6-二甲基苯酚具有甜味及增浓效果、丁香酚具有芳香和沉闷的效果,但引起人们更关注的是其对卷烟安全性的影响[6-8]。酚类物质对人的呼吸道和其他器官有不良的刺激作用,有些更被确认为致癌物和联合致癌物[9-10]。

目前,酚类物质的测定主要采用气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法等,但传统的色谱法需要衍生化,前处理较繁琐,液相色谱法价格较昂贵,普及率不高[11-13]。本工作建立了气相色谱-质谱法(GC-MS)同时测定卷烟主流烟气中15种酚类成分的分析方法,通过对比分析加香前后主流烟气中酚类成分差异,为准确评价MRPs在卷烟中的加香效果及安全性提供理论支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890B/5977A 型气相色谱-质谱联用仪;CIJECTOR 型自动注射加香仪;RM200 型转盘式吸烟机;SB-3200DT 型超声波清洗机。

内标溶液:0.100 0 g·L－1,称取0.025 0 g乙酸苯乙酯,用乙酸乙酯定容至250.0 mL。

15 种酚类成分的混合标准储备溶液:含2 590 mg·L－1苯酚、2 050 mg·L－1邻甲酚、1 768 mg·L－1对、间甲酚、1 550 mg·L－1愈创木酚、1 396 mg·L－12,6-二甲基苯酚、1 990 mg·L－12,4-二甲基苯酚、1 216 mg·L－12,5-二甲基苯酚、1 060 mg·L－13,5-二甲基苯酚、966 mg·L－12,3-二甲基苯酚、2 420 mg·L－13,4-二甲基苯酚、950 mg·L－12,4,6-三甲基苯酚、690 mg·L－14-乙基愈创木酚、1 348 mg·L－14-乙烯基愈创木酚、920 mg·L－12,6-二甲氧基苯酚、1 872 mg·L－1丁香酚,称取适量的15种酚类成分标准品于50 mL容量瓶中,用内标溶液定容,使用时用内标溶液稀释至所需质量浓度。

果糖、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸均为食品级;丙二醇、氨水均为分析纯;二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷均为色谱纯;15种酚类成分标准品和乙酸苯乙酯标准品的纯度均不大于98%。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 HP-5MS 色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25μm);载气为氦气,流量1.0 mL·min－1;进样口温度280 ℃;分流进样,分流比5∶1;进样量1μL。柱升温程序:初始温度40 ℃;以10 ℃·min－1速率升温至80 ℃;再以0.8 ℃·min－1速率升温至140 ℃,保持5 min;最后以20 ℃·min－1速率升温至250 ℃。

2)质谱条件 电子轰击离子源(EI),电子电流70 e V;离子源温度230℃,四极杆温度150℃,传输线温度280 ℃;选择离子监测(SIM)模式。其余质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 MRPs的制备

根据前期试验摸索与参考相关文献[14-15],称取18 g果糖、5 g脯氨酸、2.5 g天冬氨酸和1.25 g丙氨酸,加入100 mL的丙二醇为反应底液,用氨水调节其pH 为8.5。将上述反应底液加入到带有搅拌子和回流冷凝管的三口烧瓶内,置于100 ℃的油浴中,反应3.5 h后取出,自然冷却至室温。

1.3.2 MRPs的加香试验

以95%(体积分数)乙醇溶液为溶剂,将MRPs按质量分数1‰,2‰,4‰等3个添加水平注射到平衡好的空白卷烟样品中。

1.3.3 卷烟主流烟气中15种酚类成分的测定

将卷烟样品及加香卷烟样品置于温度为(22±2)℃和相对湿度为(60±3)%的条件下平衡48 h,用剑桥滤片平衡12 h。按GB/T 19609－2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》规定的方法抽吸卷烟,用直径92 mm 的剑桥滤片捕集20支卷烟主流烟气总粒相物。抽吸完毕后,将剑桥滤片转移至150 mL 三角瓶中,加入35 mL 乙酸乙酯,超声萃取30 min,过0.45μm 有机膜后转移至色谱瓶中,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 萃取方式的选择

按试验方法考察了超声萃取和振荡萃取这两种萃取方式对15种酚类成分萃取效果的影响,结果见图1。

图1 萃取方式对15种酚类成分萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction method on extraction effect of 15 phenolic components

由图1可知:超声萃取对大部分酚类成分具有较好的萃取效果。试验选择萃取方式为超声萃取。

2.2 萃取溶剂及其用量的选择

按试验方法考察了萃取溶剂依次为二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷时对15种酚类成分萃取效果的影响,结果见图2。

图2 萃取溶剂对15种酚类成分萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction solvent on extraction effect of 15 phenolic components

由图2可知:乙酸乙酯对大部分酚类成分均有较好的萃取效果。为保证整体萃取效果,试验选择萃取溶剂为乙酸乙酯。

试验进一步考察了乙酸乙酯用量对15种酚类成分萃取效果的影响,结果见图3。

图3 乙酸乙酯用量对15种酚类成分萃取效果的影响Fig.3 Effect of amount of ethyl acetate on extraction effect of 15 phenolic components

由图3可知:随着乙酸乙酯用量的增加,大部分酚类成分含量均先增加后趋于稳定;加入35 mL乙酸乙酯时15种酚类成分已基本萃取完全。试验选择乙酸乙酯用量为35 mL。

2.3 萃取时间的选择

按试验方法考察了萃取时间依次为10,20,30,40,50 min时对15种酚类成分萃取效果的影响,结果见图4。

图4 萃取时间对15种酚类成分萃取效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction effect of 15 phenolic components

由图4可知:随着萃取时间的延长,15种酚类成分含量均呈现先增大再减小的趋势,萃取时间为30 min,萃取效果最佳,这可能是因为随着萃取时间延长,化合物结构被破坏[16]。试验选择萃取时间为30 min。

2.4 标准曲线和检出限

按仪器工作条件对15种酚类成分的混合标准溶液系列进行测定,并绘制标准曲线。15种酚类成分的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

根据3 倍标准偏差计算方法的检出限(3s),10倍标准偏差计算方法的测定下限(10s),结果见表2。

表2 线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表2 (续)

由表2可知:15种酚类成分的检出限为0.14～2.12 mg·L－1,测定下限为0.46～7.07 mg·L－1,本方法具有较低的检出限和测定下限。

2.5 精密度和回收试验

按试验方法对卷烟样品进行分析,并在卷烟抽吸后的剑桥滤片上添加15种酚类成分的混合标准溶液进行加标回收试验,平行测定5次,计算回收率和测定总量的相对标准偏差(RSD)。精密度和回收试验结果见表3。

由表3可知:回收率为86.4%～105%,RSD 为1.4%～7.2%。利用此方法测定卷烟主流烟气中15种酚类成分的含量具有很强的可靠性和准确性。

表3 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.6 样品分析

按试验方法对卷烟样品和3个添加水平的加香卷烟样品进行酚类成分的对比分析,结果见表4。

由表4可知:随着MRPs添加量的增加,主流烟气中大部分酚类成分含量及总量均呈现降低趋势。MRPs添加量为1‰时,酚类成分总量有所增加,可能与中间产物在抽吸过程的裂解有关[17],其中3,5-二甲基苯酚含量增加了12.78%,3,4-二甲基苯酚含量减少了33.34%;MRPs添加量为2‰和4‰时,酚类物质总量分别降低了1.26%和3.92%,大部分酚类成分均有明显降低,这可能与MRPs的抗氧化活性及清除自由基作用有关[18]。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples

卷烟样品的选择离子流色谱图见图5。

图5 卷烟样品的选择离子流色谱图Fig.5 Selected ion current chromatogram of the sample of cigarette sample

按试验方法和YC/T 255－2008《卷烟主流烟气中主要酚类化合物的测定高效液相色谱法》中方法测定卷烟样品及2‰添加量的加香卷烟样品中苯酚、邻甲酚和对、间甲酚的含量,结果见表5。

由表5可知,2种方法的测定结果一致。相比标准方法,本方法具有分析时间短、检出限低等优点。

表5 本方法和标准方法测定结果的比较Tab.5 Comparison of the results of the method and the standard methodμg·支－1

本工作以添加MRPs前后的卷烟为研究对象,通过剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物,利用溶剂萃取的方法提取香味成分,采用气相色谱-质谱法对15种酚类成分进行测定,并利用该方法对加入MRPs前后的卷烟主流烟气中酚类成分进行对比分析。本方法精密度、准确度较好。随着MRPs添加量的增加,主流烟气中大部分酚类成分含量及总量均呈现降低趋势,这在一定程度上可以提高卷烟安全性。