HPLC法测定吡拉西坦颗粒有关物质和含量

聂延君，郑静，徐玉文

(山东省食品药品检验研究院，仿制药研究与评价重点实验室，山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101)

吡拉西坦(Piracetam)是一种作用于中枢神经系统的益智药，比利时UCB研究所于1963年合成成功，适用多种原因所致的记忆减退及轻、中度脑功能障碍；也用于儿童智能发育迟缓[1-5]。吡拉西坦颗粒现行标准为国家局WS-10001-(HD)-1132-2002，现行标准中没有有关物质检查，对本品安全性缺少控制。含量测定则采用凯氏定氮法，检验过程中样品处理复杂烦琐，氮消解过程时间长，试验过程中加热温度和时间对反应终点均有较大影响。因此，为提高本品质量，简便操作，本文建立了高效液相色谱(HPLC)法测定吡拉西坦颗粒有关物质和含量，以期为质量标准提高提供技术支持。

图1 吡拉西坦和相关杂质结构

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.2 试药 原料药(东北某有限公司，批号：030180672)；吡拉西坦颗粒(江西某公司，批号：201752，201822和201824)；吡拉西坦对照品(中国食品药品检验研究院，批号：100386-201703，含量：100.0%)；杂质A(中国食品药品检验研究院，批号：190154-201501，含量：98.9%)；杂质D对照品(EP，批号：2426-054A5，含量：98.1%)。乙腈为色谱纯，盐酸、过氧化氢、磷酸氢二钾均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 有关物质检查方法[6]色谱柱为Kromasil 100-5 C18(4.6 nm×250 mm，5 μm)；流动相A为0.1%磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0±0.05)，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～20 min，95%A→80%A；20～28 min，80%A；28～28.1 min，95%A；28.1～40 min，95%A)。流速为每分钟1.0 mL；检测波长为205 nm，柱温35 ℃。进样量20 μL。系统适用性溶液：取吡拉西坦对照品约25 mg，进行碱破坏后，加杂质A对照品10 μL，稀释至刻度，摇匀。系统适用性要求：杂质D峰相对吡拉西坦峰的保留时间约为0.72，吡拉西坦峰与杂质A峰的分离度应大于3.0，吡拉西坦峰的拖尾因子应小于2.0。供试品溶液浓度为0.5 mg·mL-1，对照溶液浓度为0.5 μg·mL-1。

1.杂质D；2.吡拉西坦；3.杂质A图2 系统适用性图谱

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性试验 采用强酸、强碱、氧化、加热和光照的方式对吡拉西坦进行破坏性试验，结果各降解杂质与吡拉西坦主峰以及杂质之间的分离度均良好，能够实现有效分离，其中杂质D为主要降解杂质。

2.2.2 精密度试验 取吡拉西坦对照溶液(0.5 μg·mL-1)，精密量取20 μL照上述色谱条件连续进样6次，结果峰面积RSD为0.38%，说明该方法的精密度较高。

2.2.3 稳定性试验 取吡拉西坦颗粒供试品溶液(批号：20180202)按“2.1”项下方法制备一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h，按上述色谱条件测定，记录峰面积。结果杂质D峰面积RSD为0.18%，其他单杂峰面积RSD为0.05%，总杂质RSD为0.56%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.2.4 线性关系考察 精密称取吡拉西坦对照品适量制成每1 mL中含吡拉西坦0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 μg的溶液，作为线性溶液。照上述色谱条件分别精密量取20 μL进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果吡拉西坦在0.10～1.00 μg·mL-1范围内线性关系良好(Y=43 829X+1 652.1，相关系数r为0.999 0)。

2.2.5 准确度试验 分别精密称取吡拉西坦对照品适量，按处方量称入空白辅料，加乙腈-水(5∶95)溶解并过滤，取续滤液供试品溶液，分别制成每1 mL含吡拉西坦0.10、0.50、0.75 μg的溶液，每个浓度配制3份，照上述色谱条件精密量取20 μL进样。结果回收率平均值为97.1%。说明该方法的回收率良好。

表1 准确度试验结果表

2.2.6 检出限与定量限 分别取吡拉西坦对照品适量，加乙腈-水(5∶95)溶解并逐级稀释，定容，进样，当吡拉西坦峰信噪比(S/N)为3时，即为检出限，结果为0.01 μg·mL-1。在信噪比(S/N)为10时，即为定量限，结果为0.03 μg·mL-1。

2.2.7 耐用性试验 分别采用调整柱温(30、35、40 ℃)、色谱柱和高效液相色谱仪的方法进行耐用性试验，结果，各条件下均能满足系统适用性要求，说明该方法耐用性较好。

2.3 含量测定方法 参照有关物质方法， 采用Kromasil 100-5 C18；流动相为0.1%磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH值至6.0±0.05)-乙腈(95∶5)，由梯度洗脱调整为等度洗脱。检测波长为205 nm，流速为每分钟1.0 mL。供试品和对照品溶液浓度均为0.1 mg·mL-1的溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

A.酸破坏；B.碱破坏；C.氧化破坏；D.热破坏；E.光破坏 1.杂质D；2.吡拉西坦；3.其他杂质图3 专属性试验图谱

表2 耐用性汇总表

2.4 样品测定 根据“2.1”和“2.3”项下的有关物质和含量测定方法，对样品进行测定，具体结果见表3。

表3 有关物质检验结果汇总表

3 讨论

3.1 吡拉西坦颗粒的每天服用量较大，一般为每天2.4～4.8 g，现行标准没有设定有关物质检查，不能客观反映样品中杂质情况，属于安全性项目缺失，存在用药安全隐患，因此需增订有关物质。对酸、碱、氧化、高温、光照等破坏性试验产生的降解产物分析，杂质D是主要的降解产物，因此杂质D能间接反映样品的生产工艺、处方以及贮存条件变化情况，对吡拉西坦颗粒质量控制具有重要意义，而杂质A为主要的工艺杂质，因此将杂质A和D作为已知杂质进行重点控制。按照ICH杂质限量研究的指导原则，将杂质A、D的限度拟定为不得过0.15%。其他单个杂质不得过0.1%，杂质总和不得过0.5%。

3.2 现行标准中含量测定采用凯氏定氮法，检验过程中样品和空白对照的处理复杂烦琐，消解时间长，试验过程中需控制加热温度和时间，多种因素均可对反应终点有较大影响，容易造成试验结果准确度差的问题。《中国药典》2015年版中吡拉西坦原料及相关制剂(口服溶液、片剂、注射液、胶囊)均采用高效液相色谱法测定含量[7]，制剂企业也有升级质量标准的要求。因此，为了统一标准，简便操作，含量测定方法修订为HPLC法，该方法简便、准确、可行，检测结果与现行结果比较，基本一致，因此可用于吡拉西坦颗粒的质量控制。