小儿感冒颗粒HPLC指纹图谱研究

任菲菲，郑艳青，马斐，张静，刘德丽

(德州市食品药品检验检测中心，山东 德州 253015)

小儿感冒颗粒为小儿感冒常用药，OTC乙类，由广藿香、菊花、连翘、大青叶、板蓝根、地黄、地骨皮、白薇、薄荷、石膏十味药组成[1]，收载于《中国药典》2015年版(一部)，药典中对具体药材配伍无明显规定，原标准收载项目仅有性状、检查项和靛蓝的薄层鉴别，且靛蓝的鉴别没有专属性。因其处方较为复杂，单一成分的指标不能控制其整体的工艺和质量；而指纹图谱具有多指标全面分析的功能，已广泛应用于中药材及其复方制剂的质量控制研究[2-6]。因此本试验采用高效液相色谱(HPLC)法[7]，建立了小儿感冒颗指纹图谱，可以更加系统地对小儿感冒颗粒的质量进行控制[8]。

1 仪器和试药

Agilent-1260高效液相色谱仪，紫外检测器，Milli-Q Integral 超纯水系统。

绿原酸对照品(批号:110753-201716，中国食品药品检定研究院)；木犀草苷对照品(批号:111720-201609，中国食品药品检定研究院)；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(批号:110821-201514，中国食品药品检定研究院)；连翘苷对照品(批号:110821-201514，中国食品药品检定研究院)。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

31批小儿感冒颗粒样品信息见表 1。

表1 样品信息

表1(续)

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Capcell PAK C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：0～45 min(327 nm)，45～83 min(202 nm)；进样量：10 μL，流动相：乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B)[9]，梯度洗脱条件为：0～20 min 8%～15%A；20～50 min 15%～20%A；50～60 min 20%A；60～73 min 20%～35%A；73～83 min 35%～70%A；流速：1.0 mL·min-1。

2.2 对照溶液的制备 取绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和连翘苷对照品适量，精密称定，分别置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含 50 μg的对照品溶液。

2.3 供试品的制备 取装量差异项下的本品，研细，取5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL， 密塞，称定重量，超声处理功率(500 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 精密度试验[10]取S18样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6次,各主要色谱峰的保留时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)均<1.1%，表明仪器精密度良好。

2.5 重现性试验 取S18样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，以“2.1”项下色谱条件进行测定，测定主要色谱峰面积。结果保留时间RSD均<1.5%，相对峰面积RSD均<4.5%，表明本方法的重现性良好。

2.6 稳定性试验 取S18样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在室温下，分别在 0、4、6、8、12、16、24 h进样，各主要色谱峰的保留时间RSD均<2.2%，相对峰面积RSD<5.0%，表明供试品在24 h内稳定。

2.7 小儿感冒指纹图谱的建立

2.7.1 同一企业批间相似度 将3批来自JZ公司的小儿感冒颗粒按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进行测定。将各批次样品图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012年版”(国家药典委员会)进行比较，摒弃4 min之前的溶剂峰和82 min之后的冲柱峰，确定了36个共有峰，以第一批样品为参照谱图，采用中位法，时间宽度为0.10，生成了该厂家的对照谱图(见图1)[11-12]。

图1 JZ公司小儿感冒颗粒指纹图谱(从下到上：S2、S3、S4，R-JZ公司对照谱图)

将11批ZZ公司、3批HN公司和3批WH公司的小儿感冒颗粒分别按上述方法操作，分别确定了46个、32个和33个共有峰，并分别生成了厂家的对照谱图(见图2～4)。因部分厂家仅有一批或两批样品，没有代表性，故不研究其批间相似度。

图2 HN公司小儿感冒颗粒指纹图谱(从下到上：S14、S15、S16，R-HN公司对照谱图)

结果显示，除HN厂家的1批外，其余同一厂家不同批号之间的相似度均在0.86以上，结果见表2。

图4 WH公司小儿感冒颗粒指纹图谱(从下到上：S29、S30、S31，R-WH公司对照谱图)

2.7.2 不同企业批间相似度 将31批来自11个不同企业的小儿感冒颗粒按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进行测定。将各批次样品图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012年版”(国家药典委员会)进行比较，确定了29个共有峰，校正后的保留时间分别为：5.459、5.739、8.22、8.791、9.497、10.093、15.816、16.954、22.763、24.328、33.035、37.277、38.12、40.276、45.265、46.445、47.831、49.812、51.195、56.187、58.763、69.394、72.16、73.696、74.641、76.141、76.978、78.623、81.132 min。

以S18样品为参照谱图，采用中位法，时间宽度为0.10，生成了小儿感冒颗粒的对照谱图(见图5～6)。并计算不同批次小儿感冒颗粒之间的相似度。结果表明，31批小儿感冒颗粒与对照指纹图谱的相似度结果在0.798～0.994之间(见表3)。

表3 31批小儿感冒颗粒指纹图谱相似度评价表

图5 小儿感冒颗粒参照谱图

图6 31批小儿感冒颗粒指纹图谱比较(从下到上：S1～S31，R-小儿感冒颗粒参照图谱)

2.8 共有峰的确定 分别精密吸取绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、连翘苷对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件分析，采集色谱图，根据色谱峰的保留时间定位并结合DAD光谱，确定7 号峰、14 号峰、18号峰、22号峰分别为绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸和连翘苷(见图7～11)。

图7 样品色谱图

2.9 系统聚类分析 将 29个共有峰的峰面积数据导入 SPSS 19.0软件，聚类法采用组间均联法，选用夹角余弦为刻度[13]，上述30个样品聚类分析结果见图12。聚类分析将30个样品分为3类，其中11、13号为第一类；10为第二类，其他均为第三类 。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 供试品溶液中绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸在327 nm[14]波长下有很好的响应，而连翘苷在202 nm[15]波长下有较好的相应，所以选择双波长切换的方法，在此波长条件下，可以更加全面的比较各企业间的投料区别。

图8 绿原酸

图9 木犀草苷

图10 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸

图11 连翘苷

图12 小儿感冒颗粒聚类分析树状图

3.2 流动相的选择 该试验先后考察了甲醇-0.2%磷酸和乙腈-0.2%磷酸[16]不同的流动相，结果显示乙腈-0.2%磷酸体系下样品响应值较强，通过反复试验确定了洗脱比例，在该洗脱比例下各个峰均能得到很好的分离。

3.3 同企业不同批次样品相似度分析 HN公司有S13样品相似度为0.782，经分析此批样品为2017年生产，其余两批为2018年生产，提示该企业2017年、2018年在原材料的购买、工艺的提取等方面有一定的调整；ZZ公司除S20样品相似度为0.867，其余样品相似度均在0.946以上，研究样品批次可以看出S20为2017年10月份生产，提示10月份生产的样品原料和工艺可能有一定的问题，有待进一步的考察。

3.4 不同企业样品相似度分析 ZZ公司的样品确定了46个共有峰，绿原酸、木犀草苷、连翘苷峰面积普遍高于其他企业，提示该公司在原料的选择和工艺的流程设计有明显的优势，GX公司编号为S6的样品相似度为0.786，提示为异常样品，但因只有一批样品，无法分析其具体原因，仍需进一步考察。

本试验建立了31批次小儿感冒颗粒的指纹图谱并对数据进行了分析，为质量监督管理部分评价小儿感冒颗粒的质量提供了基本数据，并为小儿感冒颗粒的质量控制提供了新的思路。