基于网络药理学的丹参川芎嗪注射液入血成分治疗脑梗死机制分析

段凯旋，刘志强，王博龙

(1.宜春学院，江西 宜春 336000；2.鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁 458030)

中药复方是中华民族使用天然药物千百年的经验结晶，由于其化学成分复杂，导致药效物质不明。复方药效物质的研究方法有多种，其中通过分析复方口服给药后血中移行成分，确定其体内直接作用物质，已成为快速确定复方药效物质的有效途径之一[1]。丹参川芎嗪注射液主要有效成分均是对脑血管治疗的有效药物,现代研究发现[2]丹参素具有溶解纤维蛋白,降低血液黏度,改善微循环的作用，而川芎嗪则可以扩张脑血管,预防血小板凝聚,降低脑耗氧量。目前针对丹参川芎嗪注射液的药理学研究已有一些报道，但其治疗脑梗死的作用机制研究尚未完全明确。而网络药理学是融合了药学、生物学、计算机学及复杂网络分析等多学科的新技术与新成果，在预测和辨识中药活性成分群及作用靶点、阐明作用机制、解释组方规律、发现新适应证及新活性化合物等方面，具有独特优势和巨大潜力[3]。本文通过网络药理学的方法对其治疗脑梗死的作用机制进行研究，以期望为后续研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 入血成分治疗脑梗死靶点筛选及其网络构建 根据文献报道[4-5]确定丹参川芎嗪注射液14种入血成分(见表1)，并通过TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetSprediction.ch/)检索丹参川芎嗪注射液入血成分靶点，然后利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点转换成对应靶点。在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“Cerebral infarction、Ischemic stroke”为检索词，搜索脑梗死靶点，将脑梗死靶基因与丹参川芎嗪注射液入血成分靶点同时输入Venny 2.1软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，筛得二者靶基因交集作为作用靶点，将入血成分及其靶点导入 Cytoscape 3.7.1 软件构建入血成分-靶点网络图。

表1 丹参川芎嗪注射液入血成分

1.2 靶点的相互作用研究 将筛选得到的作用靶点导入STRING平台(https://string-db.org/)构建靶蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI)，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“medium confidence”，其他参数保持默认值。将 PPI 网络导入Cytoscape 3.7.1软件，利用“Network Analysis”功能进行网络拓扑属性分析筛选出关键靶点。

1.3 关键靶点的KEGG通路研究 利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析，物种与背景设置均为“Homo sapiens”(智人)进行操作，研究靶点投射的 KEGG 信号通路与疾病之间的相互关系，并通过Omicshare软件 (http://www.omicshare.com/tools/index.php/)，对富集分析结果进行可视化分析，明确其治疗脑梗死的主要药理机制。

2 结果

2.1 入血成分治疗脑梗死靶点及其网络图 将TCMSP、Swiss Target Prediction数据库检索得到的146个入血成分靶点，与Gene cards数据库挖掘到的2 538个脑梗死靶点筛重，得到83个入血成分治疗脑梗死的靶点(见图1)。图2为入血成分-治疗脑梗死靶点网络图，共有个124节点，235条边，每个入血成分均能作用于多个治疗脑梗死的靶点，体现了丹参川芎嗪注射液治疗脑梗死具有多成分、多靶点的特征。

图1 脑梗死-入血成分靶点韦恩图

图2 入血成分治疗脑梗死靶点网络图(菱形：丹参川芎嗪注射液；圆形：入血成分；三角形：脑梗死；椭圆形：作用靶点)

2.2 靶点PPI网络分析 如图3所示，PPI网络共有82个节点(1个靶点未参与)，686条相互作用连线，每个参与互作的蛋白节点用一个圆圈表示，圆圈面积越大表示其度值越大，圆圈周线越粗代表其介数越大，PPI关联网络平均度值为16，平均介数为1.2×10-2，均超过平均值的靶点共有18个(见表2)，以此作为治疗脑梗死的关键靶点。

图3 靶点PPI网络

表2 关键靶点及其拓扑参数

2.3 关键靶点的KEGG通路分析 以P<0.05作为筛选标准，富集18个关键靶点的KEGG通路，如图4所示33条信号通路，其中与脑梗死密切相关的有PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路和血小板激活等。

图4 KEGG信号通路点状图

3 讨论

脑梗死又称缺血性脑卒中，属于中医中风范畴，其发病常与风、火、痰、虚、瘀等因素相关。中医学理论认为，瘀血贯穿于该病发生、发展的始终，因此以活血化瘀、补气养血为施治原则。随着现代人们生活节奏加快和饮食结构不良，脑梗死发病率上升，且发病人群呈年轻化的趋势。丹参和川芎是经典的活血化瘀类中药，由其有效成分精制而成的中药注射液，广泛应用于脑梗死的临床治疗，但其药效成分众多，作用靶点及机制尚未完全揭示。

本研究以丹参川芎嗪注射液中丹参素、丹酚酸B、川芎嗪等14种入血成分为研究对象，预测出NOS3、VEGFA、IL-4、IL-2、F2等关键药效靶点，而实验也证实丹参川芎嗪注射液有效成分能够直接或间接作用于这些靶点。如NOS3又称eNOS，是内皮型一氧化氮合酶，能够催化血管内皮细胞合成一氧化氮(NO)，而NO是重要的血管舒张因子，能够扩展血管改善脑梗死区域的血液供应。程先超等[6]发现川芎嗪可升高血浆中NO水平，改善脑部微循环，增加局部脑血流量，保护缺血区脑组织。F2在凝血机制中起着中心作用，可以激活纤维蛋白原，诱导血小板聚集，导致血栓形成，而丹参川芎嗪注射液能明显降低脑梗早期患者血清F2水平[7]。VEGFA是VEGF主要的亚型，具有诱导血管新生、促血管内皮细胞增殖等生物活性[8]。薛亮等[9]研究发现，丹酚酸B能够促进VEGF mRNA的表达，保护内皮细胞。此外，川芎嗪、丹参素还可以下调白介素减轻血管内皮细胞损伤[10-11]，且联合应用对缺氧损伤的血管平滑细胞具有一定的协同保护作用[12]。由此可见，无论是从网络药理学预测还是他人实验结果来看，丹参川芎嗪注射液主要通过上述靶点，来改善微循环、抗凝、保护血管内皮细胞，进而发挥治疗脑梗死作用。

通路富集可有效了解丹参川芎嗪注射液靶点的整体协同作用，KEGG通路研究显示靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路和血小板激活等。其中PI3K-Akt被认为是缺氧缺血后脑细胞凋亡的主要信号通路，调控PI3K-Akt能够减轻脑损伤。虽无丹参川芎嗪注射液调控PI3K-Akt信号通路治疗脑梗死的实验，但已证实丹参酮IIA、川芎嗪能通过调控PI3K-Akt通路促进心肌细胞存活、缩小梗死面积，而防治心肌缺血再灌注损伤[13-14]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对丹参川芎嗪注射液入血成分的作用靶点及其信号通路进行了系统研究，为丹参川芎嗪注射液的临床应用提供了科学依据。