基于UPE 技术对胃溃疡模型小鼠的探究

曹家桢，王富春，赵晋莹，刘雁泽,李 铁,哈丽娟

（长春中医药大学，长春 130117）

胃溃疡是常见的慢性胃肠道消化疾病，是由多种内源性或外源性因素如外界应激、幽门螺杆菌感染、非甾体类抗炎药及不良生活习惯等因素造成，导致侵入性因子（胃酸—胃蛋白酶）和防御性因子（黏液—碳酸氢盐）失衡[1]，造成胃黏膜及肌层受损或坏死，诱发溃疡性病变，以胃黏膜损伤形成溃疡灶或伴有穿孔出血为主要表现[2]。近年来，超微弱发光（Ultraweak-emission,UPE）技术逐渐在临床诊断及基础医学研究中得到应用，其中以电荷耦合器件（charge-coupled device，CCD）为主的图像采集系统通过采集光子计数形成二维图像，以获取生物体的UPE 强度的时间及空间信息，多用于检测生物体的自发辐射情况[3]。为了在不损伤动物的情况下观察胃溃疡造模情况，运用活体成像监测是研究的关键手段之一。本研究拟采用UPE 技术，以应激性胃溃疡小鼠模型为观察对象，通过CCD 图像采集系统观察其自发光光子强度及图像情况，判断胃溃疡造模成功与否，从而为探索胃溃疡的相关机制研究奠定方法学基础。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 选用SPF 级雄性DBA/1J 小鼠16 只，体质量（15±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养于长春中医药大学针灸推拿研究所动物房，饲养条件：环境温度（20±3）℃，湿度（50±2）%，12 h 明暗交替，自由摄食和饮水，适应性喂养1 周。采用完全随机法进行分组，空白组8 只，模型组8 只。实验过程严格遵循国家卫生研究院实验动物护理与使用指南。

1.2 主要试剂和仪器 鲁米诺单钠盐（阿法埃莎化学有限公司），PBS 磷酸盐缓冲粉剂（北京鼎国昌盛公司），异氟烷（河北一品制药股份有限公司），恒温水箱（常州诺基公司），CCD 图像采集系统（iXon 888，北爱尔兰Andor公司），小动物呼吸麻醉机（Matrx VIP3000，美国MIDMARK 公司）

1.3 造模方法 造模方法采用冷水束缚应激法[4]，将模型组小鼠禁食不禁水24 h，放入由50 mL 离心管自制的冷束缚装置中，使小鼠保持站立姿势。在离心管上部制造通气孔，以使小鼠在整个冷束缚过程中保持正常呼吸，并在侧壁制造多个孔洞，使冷水流入离心管内，保持内外水温一致。将冷束缚装置固定在钉板上，放置进恒温水箱中，使水平面保持在胸骨剑突位置，水温（22±2）℃，4 h 后将小鼠取出。

1.4 CCD 图像采集系统 整个实验测试在暗室内完成，该暗室内无任何光源，墙壁及地面均刷黑色油漆，无任何磷光或合成色，温度保持在（20±1.0）℃，暗室内仪器的布局如图1 所示。实验人员在进入暗室前将饰品、金属物品等发光物品卸下，用中性香皂（无香味、无酒精）清洗手部。进入暗室后，更换黑色工作服。实验过程中的照明均采用自制的红光手电筒，经测试这种光对测试结果无影响。

CCD 图像采集系统采用背照式CCD 201 相机，像素分辨率为1024×1024，像素大小为13 μm2，暗电流每秒＜1 电子/像素。使用0.95/25 mm 氙气透镜，附带有16 mm 图像传感器，最大光圈f=0.95，使其在低光照条件下也能提供良好质量的图像。相机光谱灵敏度范围约为200～1 000 nm，在575 nm 时达到量子效率峰值（92%）。该系统配备有冷却头及水冷式冷却机，最低可将CCD 相机温度维持在-120 ℃。

图1 暗室内布局

1.5 观察指标 CCD 成像观察：将小鼠及小动物呼吸麻醉机提前放置在暗室内，进行2 h 暗适应。以2.5%浓度的异氟烷0.5 L/min 麻醉条件下完成诱导麻醉后，放置在观察台上，以1.5%浓度异氟烷0.5 L/min 的麻醉条件维持麻醉，小鼠呈仰卧位。采用Andor Solis 4.3图像采集软件运行Single 模式对小鼠胃部在体表投影位置进行拍照，以确保镜头在小鼠胃部正上方，两者之间距离为30 cm。在确定位置之后，以Accumlate 模式对小鼠进行图像采集15 min。完成后按体质量浓度10 μL/g 对每只小鼠腹腔注射相应量的0.01 mg/μL 鲁米诺溶液。鲁米诺[5]是一种小分子光子供体，可被活性氧（ROS）激活产生更强的光子，是常用的光子增强剂，对生物无危害。2 min 后再以Accumlate 模式进行图像采集15 min，观察CCD 成像情况。

光子强度：运用Andor Solis 4.3 软件选定小鼠左上腹部为测试部位，对其范围内的光子强度进行数字化提取，导出到Excel 表格中，定量分析2 组小鼠组内及组间注射鲁米诺前后光子强度差异。

胃黏膜观察及溃疡指数评分：测试完成后将小鼠从暗室取出，颈椎脱臼处死，立即剖腹取胃，沿胃大弯剪开胃壁，用磷酸盐缓冲液（PBS）在冰上对胃黏膜进行漂洗数次后，将胃黏膜展开，平铺于显微镜下，以10 倍视野观察并按Guth 标准计算胃黏膜损伤指数[6]：斑点糜烂计1 分，糜烂直径＜1 mm 为2 分，1 mm ＜糜烂直径＜2 mm 之间计3 分，2 mm ＜糜烂直径≤4 mm 计4 分，糜烂直径＞4 mm 计5 分，宽度＞2 mm 时分值×2，最后所得分相加为溃疡指数。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，所有数据先进行正态检验和方差齐性检验，符合正态分布的以均值±标准差（）表示。组内比较用配对t检验，组间比较用独立样本t检验，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组小鼠CCD 图像观察 从采集的图像可观察到CCD 相机在暗室环境下均可捕捉到小鼠图像。通过肉眼观察，小鼠整体轮廓清晰，且2 组小鼠胃部图像无显著差异。在注射鲁米诺后，模型组小鼠左上腹部近胃部光子强度明显增强，并可出现白色圆形光团；空白组小鼠无明显改变，见图2。

图2 各组小鼠UPE 图像

2.2 2 组小鼠胃部光子强度比较 见表1。

2.3 2 组溃疡损伤指数比较 空白组小鼠胃黏膜光滑，无黏膜糜烂、出血等损伤；模型组小鼠胃窦部有条形点或片状出血糜烂灶，直径＜2.5 mm；Guth 指数为（3.13±0.64）分，2 组有显著差异（P＜0.05），提示造模成功。

表1 2 组小鼠胃部光子强度比较（）

表1 2 组小鼠胃部光子强度比较（）

注：与空白组注射鲁米诺前比较，# P ＜0.05；与空白组注射鲁米诺后比较，△P ＜0.05；与模型组注射鲁米诺前比较，▲P ＜0.05

3 讨论

目前，生物光学成像技术已成为生物医学研究的重要工具，将新型宏观光子成像技术与数字化分析手段结合，为研究人员提供了多种可视化生物观察技术的同时，也提供了科学的研究技术。UPE 技术作为一种非侵入性监测手段，能有效的对机体生理、病理情况进行长期观察。特别是以CCD 为主的图像采集系统在实验研究中被广泛实使用。

本研究通过采集CCD 图像与光子能量的差异变化验证胃溃疡小鼠的造模成功与否，确定UPE 技术为观察胃溃疡造模成功的有利手段。通过本方法，不需要将小鼠解剖观察胃黏膜损伤指数，可以在活体状态下观察胃溃疡造模的成功情况，确立胃溃疡模型，节约实验成本、人力及物力资源，为实验的后续研究奠定了方法学基础。本次实验通过对束缚冷应激之一造模方法进行胃溃疡的造模及光子强度的判断，既对胃溃疡的机制研究提供了理论依据，且为后续针刺治疗胃溃疡的机制研究奠定了基础。