MicroRNA-374a-5p水平与混合型深静脉血栓形成患者临床特征的关系及在预后判断中的价值*

霍艳兵，彭琪，彭星华，赵忠良

（邯郸市第一医院 血管外科，河北 邯郸 056002）

下肢深静脉血栓形成（deep venous thrombosis,DVT）是临床常见的血栓疾病。急性期DVT 如未得到有效治疗，会因血栓机化引发下肢深静脉血栓后综合征（postthrombotic syndrome, PTS），严重影响预后[1]。临床治疗DVT 的常用方法是溶栓治疗，导管直接接触血栓（catheter-directed thrombolysis, CDT）联合抗凝治疗通过导管直接接触血栓，增加血栓处药物浓度[2-3]。microRNA 是一类内源性且高度保守的非编码单链RNA[4]，DVT 患者外周血和单个核细胞中microRNA-374a-5p（miR-374a-5p）存在异常表达，提示相关microRNA 可能参与DVT 的病理生理过程[5]。因此，本研究拟分析miR-374a-5p 表达水平与下肢DVT 患者临床特征的关系及在预后判断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月—2016年12月邯郸市第一医院收治的下肢DVT 患者80 例，以患者治疗前miR-374a-5p 表达水平的中位数为临界值分为高表达组和低表达组，每组40 例。同时以同期本院60 例健康体检者的miR-374a-5p 表达水平作为参照（健康组）。所有患者采用胫前静脉入路溶栓治疗。收集所有研究对象的临床资料，包括性别、年龄、发病时间、发病部位、疾病史等信息。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

纳入标准：①所有患者下肢深静脉造影诊断为下肢DVT，且分型符合混合型诊断标准[6]：血栓累及整条肢体，包括累及髂静脉、股总静脉及股浅静脉，合并累及腘静脉或膝下静脉；②不存在抗凝溶栓治疗和介入手术治疗禁忌证；③第1 次发病，就诊时间均在发病2 周内；④无严重心、肝、肺、肾功能不全；⑤年龄≥18 周岁；⑥签署知情同意书。排除标准：①慢性或亚急性下肢DVT 者；②双侧下肢均存在DVT 且分型不属于混合型者；③伴有严重精神疾病，恶性肿瘤，严重心、肝、肺、肾功能不全或伴有代谢性疾病者；⑤患有肺动脉栓塞者；⑥临床资料不完整或未签署知情同意书者。

1.2 仪器与试剂

Aegisy 滤器[先健科技（深圳）有限公司]，交换导丝（日本泰尔茂公司），4 F VER 导管（美国强生公司），UniFuse 溶栓导管（深圳宏泽渊博科技有限公司）。总RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒[赛默飞世尔（中国）公司]，PCR 试剂盒（Sigma-Aldrich 中国公司）。

1.3 治疗方法

1.3.1 滤器置入所有患者取平卧位，以健侧腹股沟处股总静脉体表投影处为穿刺点，使用1%利多卡因局部麻醉后，应用Seldinger 穿刺法顺行穿刺健侧股静脉，置入4 F 鞘管造影，明确髂静脉及下腔静脉通畅，内无明确漂浮血栓，管径无异常，明确肾静脉开口位置及无双下腔静脉征象。选择大小适宜滤器，通过交换导丝置换滤器置入鞘管，将滤器输送到预定位置，释放固定后造影确认滤器位置及形态。在术后2 周内将滤器取出。

1.3.2 置管在患肢踝关节上方位置扎上止血带后穿刺足背静脉并注射造影剂，明确胫前静脉位置，顺行造影引导下穿刺胫前静脉成功后置入5F 血管鞘，造影明确血栓位置，应用4F VER 导管及超滑导丝通过血栓段，更换交换导丝，于近心端置入溶栓导管，溶栓导管长度选择30 cm，导管头端突出血栓近心端约1 cm。

1.3.3 溶栓药置入及监测固定溶栓管位置后，针对患者具体情况经溶栓管注入20 万u ～50 万u 尿激酶于血栓内。术毕加压包扎股静脉穿刺点24h，常规包扎患侧胫前区溶栓管置入部位。术后微泵每天泵入尿激酶50 万u ～75 万u，分2、3 次泵入，并于1 h 内泵入完毕。溶栓治疗过程中，对患者患肢行溶栓管造影1 次/2 d，并根据造影结果调整溶栓管位置。监测患者血浆纤维蛋白原、凝血酶时间、D-二聚体及活化部分凝血活酶时间等指标，经溶栓管造影确定血栓溶解完全后拔除溶栓管，并根据患者血栓溶解情况回收滤器，若经1 个月治疗，评估患者仍有并发肺动脉栓塞（pulmonary embolism, PE）风险则将滤器转化为永久型。患者出院后继续口服华法林0.5 ～1.0年，保持国际标准化比值（NR）为2.0 ～3.0。对患者进行定期随访，随访期为2年。

1.4 miR-374a-5p 表达量测定

混合型DVT 患者和健康组分别于入院治疗前、体检时清晨抽取空腹静脉血5 ml，即刻3 500 r/min 离心15 min，取上清液，置入-30℃冰箱冷冻保存。采用总RNA 提取试剂盒提取外周血中总RNA，使用紫外分光光度计测定提取的总RNA 浓度，样品A260/A280 ≥1.80 视为合格。然后采用逆转录试剂盒将总RNA 进行逆转录，分别得到模板单链cDNA，然后参照PCR 试剂盒操作步骤对cDNA 进行PCR。设置的PCR 反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性40 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s；连续循环40 次。采用2-△△ct法计算miR-374a-5p 的相对表达量[7]。

1.5 考察指标

1.5.1 治疗前后患者患肢肿胀程度分别于治疗前后测量患者髌骨上侧20 cm 处及髌骨下侧15 cm 处周径，作为患侧与健侧下肢大小腿周径，患肢消肿率=（术前患健侧肢体周径之差-术后患健侧肢体周径之差）/术前患健侧肢体周径之差×100%[8]。

1.5.2 患者血栓清除率及评分通过造影比较两组患者术后血栓清除效果，分为3 级[8]。3 级：患肢症状或体征完全消失，血栓清除率＞95%，深静脉血流通畅，评分为3 分；2 级：患肢症状或体征明显好转，血栓清除率为50%～95%，评分为2 分；1 级：患肢症状或体征无明显好转甚至恶化，血栓清除率＜50%，评分为1 分。

1.5.3 治疗前后患者静脉通畅度评分采用Moneta评分评估患者静脉通畅度，涉及静脉包括下腔静脉、髂总静脉、髂外静脉、股总静脉、股浅静脉上下段和腘静脉，完全通畅、部分通畅和未通畅分别记为0、1、2 分[9]。

1.5.4 患者并发症发生情况观察两组患者感染、皮肤黏膜出血、穿刺点血肿、血尿血便等并发症发生情况，比较两组患者总并发症发生率。

1.5.5 治疗后患者PTS 发生率及严重程度采用Villalta 评分表征PTS，Villalta 评分内容包括肌肉抽筋、皮肤瘙痒、疼痛、沉重感及感觉异常5 项症状，以及浅静脉扩张、色素沉着、胫前水肿、皮色发红、脂质硬化6 项体征，根据患者症状和体征的严重程度分为无、轻度、中度、重度，评分分别为0、1、2、3 分，将5 项症状和6 项体征分值相加作为Villalta 评分总分，根据Villalta 评分总分判定PTS 严重程度，总分＜5 分表示未发生PTS，5 ～9 分表示轻度PTS，＞9 ～14 表示中度PTS，＞14 分表示重度PTS。若患肢发生过溃疡则判定为重度PTS[10]。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用独立t检验、配对t检验或单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验，等级资料以等级表示，比较用秩和检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组miR-374a-5p 相对表达量比较

高表达组、低表达组和健康组miR-374a-5p 相对表达量分别为（1.75±0.18）、（1.31±0.23）和（1.02±0.25），3 组比较，差异有统计学意义（F=109.698，P=0.000），进一步两两比较，高表达组高于低表达组和健康组（P＜0.05），低表达组高于健康组（P＜0.05）。

2.2 两组患者临床资料比较

高表达组和低表达组患者性别构成比、发病明显诱因、患健侧大腿周径差、患健侧小腿周径差、静脉通畅度评分比较，差异无有统计学意义（P＞0.05）；高表达组患者年龄、首发症状至就诊时间大于或长于低表达组（P＜0.05），且高表达组患者骨科疾病手术史比例高于低表达组（P＜0.05）。见表1。

2.3 两组患者治疗前后患肢肿胀程度比较

治疗后高表达组和低表达组患者患健侧大、小腿周径差较治疗前均减小（P＜0.05），但两组患者治疗后大、小腿周径差及消肿率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 两组患者临床资料比较 （n =40）

表2 两组患者治疗前后患肢肿胀程度比较 （n =40，±s）

表2 两组患者治疗前后患肢肿胀程度比较 （n =40，±s）

组别患健侧大腿周径差/cm 患健侧小腿周径差/cm 大腿消肿率/%小腿消肿率/%治疗前 治疗后 t 值 P 值 治疗前 治疗后 t 值 P 值高表达组 5.55±0.36 1.72±0.11 177.181 0.000 4.93±0.31 1.71±0.12 72.701 0.000 73.20±8.62 68.25±5.85低表达组 5.51±0.34 1.71±0.14 177.299 0.000 4.94±0.29 1.70±0.15 73.106 0.000 75.25±8.25 67.52±5.56 t 值 0.511 0.355 0.149 0.329 1.087 0.572 P 值 0.611 0.723 0.882 0.743 0.281 0.569

2.4 两组患者静脉通畅度评分和血栓清除率比较

治疗后高表达组和低表达组患者患肢静脉通畅度评分均较治疗前低，但两组治疗后静脉通畅度评分及血栓清除率评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.5 两组患者并发症发生情况比较

治疗期间，高表达组并发症发生率为15.0%，与低表达组的17.5%比较，差异无统计学意义（χ2=0.092，P=0.762）。见表4。

2.6 两组患者治疗后PTS 发生率及严重程度比较

术后随访2年，高表达组和低表达组PTS 发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），高表达组高于低表达组。且高表达组患者PTS 严重程度高于低表达组（P＜0.05）。见表5。

表3 两组患者静脉通畅度和血栓清除率评分比较（n =40，±s）

表3 两组患者静脉通畅度和血栓清除率评分比较（n =40，±s）

静脉通畅度评分 血栓清除率评分治疗前 治疗后 t 值 P 值高表达组 8.94±1.32 3.38±0.61 28.395 0.000 2.68±0.15低表达组 8.92±1.28 3.39±0.64 28.539 0.000 2.66±0.12 t 值 0.069 0.072 0.658 P 值 0.945 0.943 0.512组别

表4 两组患者并发症发生情况比较 [n =40，例（%）]

表5 两组患者治疗后PTS 发生率及严重程度比较（n =40）

3 讨论

抗凝治疗是以往临床上治疗DVT 的标准疗法，可以有效缓解血栓蔓延及肺栓塞发生、发展进程，但对预防PTS 发生及提高深静脉通畅度效果不佳。目前国内DVT 诊治指南推荐的DVT 治疗首选方案是CDT治疗。目前临床CDT 常用置管部位有健侧股静脉、大小隐静脉、患侧股静脉等。经健侧股静脉入路置管溶栓穿刺简单，但其属于逆行置管，容易损伤深静脉瓣膜；且瓣膜对导丝通过股静脉的阻碍较大，置管难度较高且置管成功率较低，大大提高PTS 的发生风险。而经皮胫前、后静脉置管属于顺行置管，不易损伤深静脉瓣膜，且操作简便[11]。

MicroRNA 是一种由20 ～25 个核苷酸组成的人体内源性非编码小分子RNA，也是生物体内重要的一种转录后调控因子，可参与调节胚胎发育、细胞分化凋亡等多种生物学过程[4]。周兰庭等[12]报道多种疾病如脑梗死、心肌梗死、帕金森病、肿瘤、糖尿病等患者外周血中microRNA 表达异于健康人群。外周血microRNA 有望成为疾病诊断治疗以及预后判断的新型生物学标志物。miR-374a-5p 作为microRNA 的重要亚型，在DVT 患者外周血中存在异常表达，可能是DVT 治疗的一种新靶点[5]。本研究结果显示，高表达组患者miR-374a-5p 相对表达量高于低表达组患者和健康组，高表达组患者年龄、首发症状至就诊时间大于或长于低表达组，且高表达组患者具有骨科疾病手术史的比例高于低表达组。可能是由于老年患者相比于年轻患者，不仅凝血功能更加亢进，血管壁老化现象也更加明显，而血管壁老化会进一步改变血管内血液流变状态[13]。而患有骨科疾病或有相关疾病手术史患者卧床时间增加，这些因素会加剧患者血管痉挛状态和改变血液流速，时间一久容易发生下肢静脉回流瘀滞，从而增加PTS 发生的可能性。另外，时效性是影响DVT 的治疗效果及术后复发的重要因素之一，早发现早治疗有利于及时干预和治疗，故缩短首发症状至就诊时间显得十分重要[14]。

本研究结果显示，治疗后两组患者患健侧大、小腿周径差均减小、患肢静脉通畅度评分均降低，但两组患者大小腿周径差减小程度、消肿率以及患肢静脉通畅度和血栓清除率无差异；治疗期间高表达组和低表达组并发症发生率无差异。术后随访2年，高表达组PTS 发生率高于低表达组，且两组患者PTS 严重程度有差异。说明miR-374a-5p 表达量对于患者近期疗效无影响，但miR-374a-5p 表达量仍可能会影响患者远期PTS 发生率，提示miR-374a-5p 仍是影响DVT发生发展的重要因素。CEOLOTTO 等[15]研究结果证实miR-374a-5p 在机体炎症反应过程中发挥重要作用。PAN 等[16]研究发现，miR-374a-5p 会通过与炎症因子IL-10 mRNA 3'UTR 位点发生结合，使得IL-10 表达受到抑制，进一步引发炎症造成血管内皮细胞受损，从而参与DVT 的发生和发展。SEBASTIANI 等[17]研究结果显示，miR-374a-5p 水平与DVT 严重程度呈正相关，miR-374a-5p 作为与DVT 严重程度相关的生物学指标，可以调控患者发病时的炎症因子表达水平，从而加剧患肢炎症反应，导致预后不良[18]。SPIEZIA 等[19]报道溶栓、导管溶栓等治疗方法可以改善DVT 患者术后近期临床症状及血栓栓塞情况，但术后远期PTS 发生情况仍主要取决于患者恢复过程中患肢血栓自身溶解、机化和再通过程，而静脉血栓溶解再通过程由众多因子、细胞和机制参与和调节。DERNOWSEK 等[20]报道miR-374a-5p 等microRNA 可以通过广泛参与和调控血管内皮细胞迁移及成血管分化等途径影响静脉血栓溶解再通过程，其对比研究发现miR-374a-5p 可促进血管内皮细胞归巢，而下调miR-374a-5p 可促进血管内皮细胞对血栓的溶解再通。

综上所述，miR-374a-5p 在混合型DVT 患者中高表达，且高、低表达者在年龄、首发症状至就诊时间及骨科疾病手术史中存在差异，miR-374a-5p 高表达会增加患者远期PTS 发生率及严重程度。