右美托咪定减轻兔脊髓缺血再灌注损伤的机制研究*

樊晓娜，刘娇，池卉，袁芬，胡霁

（华中科技大学同济医学院附属梨园医院 麻醉科，湖北 武汉 430077）

α2肾上腺素受体激动剂——右美托咪定（Dexmedetomidine, Dex），因其优越的抗焦虑及镇静作用，被广泛应用于临床麻醉和重症监护[1]。此外，它对神经系统的保护作用，在体内外动物模型中均已得到证实[2-3]。研究表明，在脊髓缺血前及缺血期给予实验动物Dex，可显著增加其脊髓神经元的存活率[4]。然而，当Dex 被持续应用至再灌注期间时，其效应及效应机制如何，尚未明确。信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）是一种调节编码参与多种过程的蛋白质基因表达的转录因子，包括炎症、凋亡、血管生成、细胞信号转导和细胞应激反应等[4]。研究表明，Janus 激酶2（Janus kinase 2, JAK2）/STAT3 信号通路的激活，能够通过其抗凋亡及抗炎等作用机制，保护器官组织免受缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）损伤[6-7]。在小鼠脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemiareperfusion injury, SCIRI）模型中，OSUKA 等[8]也认为磷酸化的STAT3 可通过转运至细胞核，刺激相关基因转录，减轻神经组织损伤。而Dex 对JAK2/STAT3通路的这种激活作用，在脑保护相关机制研究中已经得到证实[9]。那么，Dex对SCIRI的减轻作用是否与其激活JAK2/STAT3 信号通路，进而调节下游信号分子的表达，以抑制脊髓炎症及神经细胞凋亡有关，未有相关研究报道。本研究将通过复制兔SCIRI模型，探讨Dex 对SCIRI 的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

兔抗p-JAK2（美国Biocompare 公司），p-STAT3（中国博奥森生物技术有限公司），活化型半胱天冬酶-3（Cleaved Caspase-3）（英国Abcam 公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）（美国Lsbio 公司）抗体，山羊抗兔二抗、RIPA 总蛋白裂解液、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、5×蛋白上样缓冲液（南非Aspen 公司），原位末端转移酶标记（TUNEL）试剂盒（瑞士Roche 公司），DAPI 染液（中国阿斯本生物技术有限公司）。超净工作台（中国苏净安泰空气技术有限公司），酶标仪（美国Diatek 公司），普通光学显微镜、倒置显微镜（日本Olympus 公司），成像系统（美国Q-Imaging 公司）。

1.2 实验动物及模型复制方法

健康成年新西兰大耳白兔78 只，体重2.0 ～2.2kg（湖北逸挚诚生物科技有限公司提供）。兔左耳缘静脉穿刺置管后，用戊巴比妥钠静脉注射（30mg/kg）麻醉。根据其生命体征和肌肉松弛情况，静脉滴注1%戊巴比妥钠维持麻醉。应确保动物能自主呼吸，并用电热毯保温使直肠温度保持在（38.5±0.5）℃。术中监测中心动脉血压、心率和血氧饱和度。采用改良的Zivin 方法复制SCIRI 模型[10]。首先，将动物置于仰卧位，剃毛和消毒后，行胸腹正中切口。然后在肾动脉水平分离腹主动脉，并在距左肾动脉入口0.5cm 远的腹主动脉上放置动脉夹以诱导缺血。30min 后移除动脉夹。仔细检查动脉壁及脏器无损伤后，关闭腹腔。手术后，所有实验动物肌内注射庆大霉素4 万u 以防止感染，送回笼子喂养。实验程序符合华中科技大学同济医学院动物实验伦理准则（2018-0630）。

1.3 实验分组及过程

1.3.1 实验一为测定Dex 未干预情况下，SCIRI 过程中JAK2/STAT3 信号通路蛋白表达情况，将42 只新西兰大耳白兔随机分为假手术组（0 h 组）、再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h 及48h 组，每组6 只。按1.2中方法复制SCIRI 模型，于再灌注后相应时间点，兔耳缘静脉注入空气20ml 处死各组实验兔，同1.7 中所述实验方法，取脊髓组织检测p-JAK2、p-STAT3 的表达。

1.3.2 实验二将36 只新西兰大耳白兔随机分为假手术组（Sham 组）、缺血再灌注损伤组（I/R 组）和Dex 干预组（Dex+I/R 组），每组12 只。Dex+I/R 组：按1.2 中方法复制SCIRI 模型，于缺血前30 min 将Dex 以10μg/（kg·h）的剂量从兔左耳缘静脉泵入，持续时间至再灌注后1h。I/R 组：按1.2 中方法复制SCIRI 模型，于缺血前30min 从兔左耳缘静脉泵入与Dex 等体积的生理盐水，直至再灌注后1h。Sham 组：按1.2 中方法，分离出腹主动脉，但不夹闭；与I/R 组相同，从兔左耳缘静脉泵入生理盐水。各组的研究时间点为再灌注损伤后48h，其中6 只用于血-脑屏障通透性检测，另外6 只用于其他相关检测。

1.4 神经运动功能评分

再灌注后48h，由1 位不清楚实验设计与分组的康复科医师，采用改良的Tarlov评分法[11]，对实验兔（均为实验二动物）后肢运动功能进行评分。评分标准：0 分，无可觉察的后肢活动；1 分，有可觉察的关节自主活动；2 分，后肢可自由活动但无法站立；3 分，后肢可站立但不能正常行走；4 分，神经功能正常。

1.5 苏木精-伊红染色观察各组脊髓组织中神经元形态

运动功能评估完成后，采用随机数字表法，每组取6 只实验兔，经耳缘静脉内注入空气20ml 处死，取L4～6段新鲜脊髓一部分固定于4%多聚甲醛中，梯度酒精脱水后行石蜡包埋。修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，厚4μm。石蜡切片脱蜡至水后，进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察脊髓组织病理改变。

1.6 TUNEL 法及DAPI 染色检测神经细胞凋亡

石蜡切片脱蜡至水后，切片稍甩干，用免疫组织化学笔在组织周围画圈（防止液体流走），滴加蛋白酶K 工作液覆盖圈内组织，37℃孵育15min。加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育10min。取TUNEL 试剂盒内适量试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）按1 ∶9混合，覆盖圈内组织，切片平放于湿盒内，37℃水浴锅孵育60min。洗涤，滴加适量DAPI 染液至切片，室温避光孵育5min。洗涤，滴加抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。荧光显微镜下呈绿色荧光者即为凋亡神经细胞。随机选取5 个视野，计数各组凋亡神经细胞数目。

1.7 Western blotting 法检测相关蛋白表达

取脊髓的另一部分，提取总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；制备12% SDSPAGE 凝胶，取蛋白样品进行上样、电泳；电泳完毕转至PVDF 膜，将转好的膜加入封闭液室温封闭1h；除去封闭液，加入稀释好的一抗p-JAK2（1 ∶500）、p-STAT3（1 ∶500）、Cleaved Caspased-3（1 ∶1000）、TNF-α（1 ∶500）及IL-6（1 ∶500）4℃过夜；洗涤后加入HRP 标记的二抗（1 ∶10000）室温孵育30min。滴加新鲜配制的ECL 混合溶液，暗室中曝光、显影。Alpha Ease FC 软件处理系统分析目标条带的灰度值，以目标条带与GAPDH 条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.8 伊文思蓝检测血-脑屏障的渗透性

对各组剩余6 只实验动物，于再灌注48h 后将2%伊文思蓝（10ml/kg）经耳缘静脉缓慢匀速注入。1h 后再次麻醉动物，打开胸腔暴露心脏，经升主动脉灌注生理盐水500ml/kg。取脊髓组织，一部分置入4%多聚甲醛内固定，沉糖，置入-20℃冷冻切片机上连续切片（10μm），于荧光显微镜绿色荧光激发模式下观察（伊文思蓝在绿色荧光激发下呈红色）。另一部分脊髓称重后浸泡于4ml 甲酰胺溶液中，60℃避光水浴24h 后离心取上清液，用酶标仪（632nm 处）检测光密度（OD）值。由绘制的标准曲线计算脊髓组织中伊文思蓝含量。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用Tukey 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCIRI 过程中p-JAK2 和p-STAT3 表达情况

再灌注后3h、6h、12h、24h、36h 和48h组，脊髓组织中p-JAK2 的相对表达量分别为（0.079±0.039）、（0.137±0.060）、（0.305±0.041）、（0.440±0.054）、（0.197±0.063）和（0.112±0.042），0h 组表达量为（0.050±0.022），7 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=50.656，P=0.000）；再灌注后3h、6h、12h、24h、36h和48h组，脊髓组织中p-STAT3的相对表达量分别为（0.110±0.034）、（0.242±0.053）、（0.449±0.051）、（0.574±0.053）、（0.299±0.040）和（0.149±0.036），0h 组表达量为（0.089±0.031），7 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=102.635，P=0.000）。与0h 组比较，再灌注后6h，脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3 的表达升高（P＜0.05）；再灌注后24h 到达峰值（P＜0.05）；再灌注后48h，其表达与0h 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 Dex 对SCIRI 后运动功能的影响

再灌注后48 h，各组Tarlov 评分结果分别为：Sham 组（4.000±0.000）、I/R 组（1.500±0.904）、Dex+I/R 组（2.917±0.668），经方差分析，差异有统计学意义（F=48.145，P=0.000）。Sham 组均无运动功能障碍；I/R 组评分低于Sham 组（P＜0.05），其运动功能严重受损；与I/R 组比较，Dex+I/R 组评分提高（P＜0.05），其运动功能障碍得到改善。见图2。

2.3 各组脊髓组织神经元形态

再灌注后48h，Sham 组脊髓组织结构完整，正常神经元数量较多；神经元呈清晰的多边形结构，胞浆均质红染；胞核形态正常、核仁明显。I/R 组脊髓组织结构被严重破坏，残存的正常神经元数量少，细胞间可见大量空泡形成；神经元多边形结构消失；胞核大量溶解。Dex+I/R 组脊髓组织结构基本完整，细胞间空泡较少，正常神经元较I/R 组多；神经元多边形结构基本存在；胞核形态大致正常，病理变化轻于I/R组。见图3。

2.4 各组脊髓组织凋亡神经细胞比较

再灌注后48h，各组凋亡神经细胞计数结果：Sham 组（2.933±1.799）%、I/R 组（39.967±10.918）%、Dex+I/R 组（12.867±3.501）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=245.495，P=0.000）。进一步两两比较，I/R 组高于Sham 组（P＜0.05），Dex+I/R 组低于I/R 组（P＜0.05）。见图4。

图1 各组脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达

图2 各组神经功能评分

2.5 伊文思蓝在各组脊髓组织中的渗透情况

再灌注后48 h，Sham 组脊髓组织中几乎未见红色荧光，I/R 组红色荧光显著增强，而Dex+I/R 组红色荧光较I/R 组明显减弱。各组脊髓组织中伊文思蓝的渗透量分别为：Sham 组（1.757±1.162）μg/g、I/R 组（15.985±2.556）μg/g、Dex+I/R 组（8.868±2.365）μg/g，经方差分析，差异有统计学意义（F=67.597，P=0.000）。I/R 组脊髓组织中的伊文思蓝含量高于Sham组（P＜0.05），血-脑屏障渗透性增强；与I/R 组比较，Dex+I/R 组的伊文思蓝含量减少（P＜0.05），血-脑屏障渗透性降低。见图5。

2.6 Dex 对p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、TNF-α、IL-6 蛋白相对表达的影响

图3 各组脊髓组织病理学结果 （HE 染色×100）

图4 各组脊髓组织凋亡神经细胞比较 （×100）

图5 再灌注48 h 后各组脊髓组织中伊文思蓝含量比较 （×200）

再灌注后48 h，各组脊髓组织中p-JAK2 蛋白相对表达量分别为：Sham 组（0.056±0.027）、I/R 组（0.113±0.046）、Dex+I/R 组（0.451±0.055），经方差分析，差异有统计学意义（F=139.649，P=0.000）；各组p-STAT3蛋白相对表达量分别为：Sham 组（0.092±0.028）、I/R 组（0.142±0.044）、Dex+I/R 组（0.583±0.048），经方差分析，差异有统计学意义（F=261.611，P=0.000）。I/R 组p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量与Sham 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而Dex+I/R 组p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量较I/R组升高（P＜0.05）。见图6。

再灌注后48 h，各组Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达量分别为：Sham 组（0.054±0.026）、I/R 组（0.320±0.043）、Dex+I/R 组（0.155±0.025），经方差分析，差异有统计学意义（F=102.559，P=0.000）；各组TNF-α 蛋白相对表达量分别为：Sham 组（0.061±0.033）、I/R 组（0.534±0.072）、Dex+I/R 组（0.248±0.074），经方差分析，差异有统计学意义（F=87.413，P=0.000）；各组IL-6 蛋白相对表达量分别为：Sham组（0.148±0.040）、I/R 组（0.489±0.071）、Dex+I/R组（0.288±0.055），经方差分析，差异有统计学意义（F=54.199，P=0.000）。I/R 组Cleaved Caspase-3、TNF-α 及IL-6 蛋白相对表达量较Sham 组升高（P＜0.05）；而Dex+I/R 组Cleaved Caspase-3、TNF-α 及IL-6 蛋白相对表达量较I/R 组降低（P＜0.05）。见图7、8。

图6 各组脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达

图7 各组脊髓组织中Cleaved Caspase-3 蛋白表达

图8 各组脊髓组织中TNF-α 和IL-6 蛋白表达

3 讨论

SCIRI 作为胸腹主动脉术后最严重的并发症之一，可导致患者严重和长期的残疾。因此，改善这种破坏性状况的新举措具有十分重要的临床意义。本研究结果表明，Dex 在缺血前30min 直至再灌注后短期内（1h），能够改善新西兰大耳白兔SCIRI 后神经功能障碍，并减轻其脊髓组织学损伤。

在SCIRI 过程中，导致神经元丢失的病理生理学机制十分复杂。因此，揭示其潜在过程是实施新型神经保护疗法的关键。SCIRI 产生的主要原因是：术中脊髓组织缺血以及血流再恢复后，氧自由基大量生成、促炎因子释放和线粒体衰竭等造成“二次损伤”[12-14]。在这一过程中，促凋亡信号诱导的运动神经元延迟和选择性死亡，以及炎症导致的血-脑屏障结构的破坏，是脊髓不可逆损伤的关键。其中，细胞凋亡被认为是SCIRI 后神经元的主要死亡方式[15]。而血-脑屏障的完整性对维持中枢神经系统稳态和内环境稳定至关重要[16]。再灌注早期，血-脑屏障的破裂和出血导致免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）浸润，引发炎症级联反应，进一步加重组织损伤[17]。因此，对血-脑屏障破坏的早期干预，可有效预防SCIRI。本研究结果显示，SCIRI 过程中，Dex 可减少凋亡神经细胞数，并降低血-脑屏障的渗透性。因此，在研究剂量内，对凋亡的抑制和血-脑屏障结构完整性的维持，可能是Dex 发挥其神经保护效应的关键。

JAK2/STAT3 信号通路的活化在老鼠器官的I/R损伤中发挥关键性的保护作用[18-19]。Caspase-3 是细胞凋亡信号的主要执行者，可由外源及内源性途径激活[20]。在体外通过氧糖剥夺模拟I/R 损伤发现，激活的JAK2/STAT3 信号通路，可通过提高Bcl-2/Bax 比值，从而降低Cleaved Caspase-3 水平，保护HT22 神经细胞免受凋亡[21]。该调节作用在心肌I/R 损伤的体外研究中，同样得到证实[22]。此外，活化的STAT3 还通过抑制下游炎症因子TNF-α、IL-6 的表达，减轻I/R损伤[7，23]。通过实验一，本研究发现，再灌注短期内，JAK2/STAT3 保护性通路被激活，但这种激活作用并未维持，这可能是导致SCIRI 加重的关键，OSUKA 等[8]的研究结果也证实了这一点。而Dex 能够激活JAK2/STAT3 信号通路，并抑制炎症因子（TNF-α、IL-6）及凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3）的表达。因此，Dex可减轻SCIRI 的潜在机制可能与其激活JAK2/STAT3信号通路，从而对炎症与凋亡进行调控有关。

综上所述，在脊髓缺血前，直至再灌注短期内连续给予Dex，可作为一种相对安全的神经保护策略，应用于SCIRI 的预防及治疗过程。此外，对JAK2/STAT3 信号通路的调节，可能为进一步寻找新的脊髓神经保护策略提供分子靶点。再者，若Dex 以低剂量的镇静浓度持续应用于再灌注后48 h，是否能提供更稳定及有效的神经保护作用，值得探讨。