SPON2基因在肾透明细胞癌中的表达与临床意义

2020-11-04 03:09马慧敏黄后宝李亚伟黄建军
皖南医学院学报 2020年5期
关键词:免疫组化试剂盒培养基

马慧敏,于 猛,黄后宝,李亚伟,张 鹏,黄建军,程 龙,冯 钢

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科;2.泌尿外科,安徽 芜湖 241001)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌中最常见的病理学类型,其发病率和病死率在世界范围内不断上升。手术切除是目前治疗肾透明细胞癌的主要方式,但约30%的患者在术后可出现肿瘤的转移[1-2]。近年来,分子靶向药物开始逐步应用于肾癌的临床治疗,极大的提高了患者的生存,但晚期ccRCC患者的预后依然较差。因此,寻找有效的肾癌分子标志物对于肾癌的早期诊断、预后判断等具有重要的临床意义。

脊椎蛋白2(SPON2)是一种细胞外基质分泌蛋白,在获得性免疫和先天性免疫中发挥着重要作用,可募集炎性细胞和促进神经元生长。近年来多项研究表明,在肝癌、结直肠癌、胃癌和肺腺癌中,SPON2的表达与患者预后存在显著相关[3-6]。但是SPON2在ccRCC中的表达及其功能,目前尚未见报道。本研究通过检测ccRCC中SPON2基因的表达情况,分析其与ccRCC患者临床病理指标的相关性,并采用体外实验研究SPON2在ccRCC中的生物学功能,旨在阐明SPON2在ccRCC中的临床意义及其功能。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本研究收集2018年1月~2019年7月弋矶山医院114例ccRCC患者肿瘤组织及其癌旁组织标本,其中男性66例,女性48例,年龄28~83岁。所有患者术前均未接受过辅助治疗。原位ccRCC定义为初次评估时无远处转移或腹膜后淋巴结转移。肿瘤分期按2010年AJCC的TNM分期标准,病理分级按Fuhrman分级标准。本研究已获得参与者的知情同意。

1.1.2 细胞株 人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)和人肾透明细胞癌细胞株(786-0细胞,Caki-1细胞)均购自于北京北纳科技有限公司。

1.1.3 主要试剂和仪器 DMEM培养基、PPMI-1640培养基、McCoys 5A培养基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液、Marker、ECL显色试剂盒(Beyotine),Lipofectamine 2000(invitrogen),SPON2抗体、β-actin抗体(Abcam),Trizol Universal、mRNA逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒(北京天根生化科技有限公司),xCELLigence 实时细胞分析仪、E-Plate板(ACEA),凋亡检测试剂(北京贝博生物公司),逆转录仪、荧光定量PCR仪、垂直电泳仪(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 取各例肿瘤组织石蜡标本切片(4 μm),按脱蜡水化、抗原修复、去内源性酶、抗原封闭、SPON2一抗、二抗孵育、发色、苏木精复染、脱水、封片、镜检、结果判定进行免疫组化染色,显微镜下随机选取5个视野观察,染色为棕黄色或棕褐色的为SPON2阳性。

1.2.2 细胞总蛋白的提取和Western Blot 细胞裂解、蛋白浓度定量后,SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜,SPON2一抗封膜并孵育过夜,二抗洗膜,加入显影液,采用凝胶成像系统分析条带显影情况。

1.2.3 细胞转染和RT-PCR 采用Lipofectamine 2000试剂盒进行细胞siRNA转染。TRIzol法提取细胞总RNA,逆转录cDNA后,qPCR扩增检测。以β-actin为内参,计算SPON2的相对表达量。

1.2.4 增殖实验和凋亡实验 向E-Plate板中加入50 μL McCoy′s5A培养基,RTCA分析仪(置于37℃ 5% CO2培养箱中)设置基线,于E-Plate 板中加入100 μL(6×103)细胞悬液,室温放置30 min,置于RTCA分析仪中,实时监测3 d。

细胞转染24 h后,胰酶消化,计数,接种于6孔培养板上,每孔接种500细胞,于37℃、5%CO2培养箱中培养10 d,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染色15 min,镜下拍照计数。

细胞转染48 h后,胰酶消化细胞,PBS洗2遍,50 μL 1×binding buffer重悬细胞,上述细胞悬液中分别加入Annexin-FITC和PI 染液各5 μL,混匀,避光孵育15 min,加1×PBS 250 μL,1 h内上机检测。

1.2.5 划痕实验和transwell侵袭实验 细胞转染24 h后,用灭菌的100 μL枪头在培养板中垂直均匀划线,PBS清洗脱落的细胞3次,每孔加入2 mL无血清培养液,置于37℃,5% CO2的培养箱继续培养,分别于0、24 h对细胞进行观察并拍照。

细胞转染24 h后,胰酶消化,用无血清的McCoy′s5A培养基配成单细胞悬液,每孔加入Matrigel 50 μL铺胶于Transwell膜小室,置于37℃ 30min。取制备的细胞悬液200 μL(5×103)加入Transwell小室上室,下室加入含10%FBS的McCoy′s5A培养基500μL,置于37℃培养箱常规培养24 h,PBS适当清洗,4%多聚甲醛固定30 min,风干,0.1%结晶紫染色15 min,PBS清洗,选取5个视野直接镜下拍照观察穿膜细胞数,取平均值。

2 结果

2.1 SPON2在ccRCC中表达增高 ccRCC癌组织中SPON2蛋白阳性表达率(60.53%)高于癌旁组织(36.84%),差异有统计学意义(χ2=12.798,P=0.000);ccRCC癌组织中mRNA表达水平高于癌旁组织(t=23.293,P=0.000)(见表1)。免疫组化显示,SPON2主要分布于胞质中,染色为棕黄色或棕褐色的为SPON2阳性表达(图1A)。SPON2 mRNA在Caki-1细胞中的表达高于HK-2细胞(P<0.05),但HK-2细胞和786-0细胞中SPON2 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。Western Blot实验也验证了上述结果(图1B),因此采用Caki-1细胞进行后续的功能研究。siRNA瞬时转染Caki-1细胞24 h后,SPON2的表达降低,表明转染成功,其中siRNA1-SPON2的敲除效果最显著(图1C)。

A.免疫组化;B.SPON2在3株细胞中的蛋白表达;C.Caki-1细胞株中SPON2干扰后的蛋白表达。

表1 SPON2在ccRCC组织及癌旁组织的表达

表2 SPON2在ccRCC细胞株中的表达

2.2 SPON2与ccRCC患者临床病理资料的关系 如表3所示,SPON2 mRNA表达水平和SPON2蛋白表达水平均和ccRCC患者的年龄、性别、组织坏死相关性无统计学意义(P>0.05),但与ccRCC患者的肿瘤直径、TNM分期、Fuhrman分级、肉瘤样改变、淋巴结转移、远端转移均存在相关性(P<0.05)。

表3 SPON2与ccRCC患者临床病理资料的关系

2.3 SPON2敲减可抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭 RTCA增殖实验显示,siRNA-SPON2组和对照组的生长曲线基本一致(图2A)。克隆形成实验显示,siRNA-SPON2组细胞克隆数(0.92±0.17)和对照组(1.00±0.00)差异无统计学意义(t=-0.833,P=0.493,见图2B)。siRNA-SPON2组细胞总凋亡率(0.77±0.21)%与对照组(0.90±0.30)%差异无统计学意义(t=-0.632,P=0.561),见图2C。划痕实验显示,siRNA-SPON2组的细胞伤口愈合率(31.00±3.60)%低于对照组(92.33±4.04)%(t=19.614,P=0.000,见图2D)。侵袭实验结果显示siRNA-SPON2组的细胞侵袭数(0.48±0.08)与对照组相比(1.00±0.00)减少(t=11.717,P=0.007,见图2E)。

A.RTCA增殖实验;B.克隆形成实验;C.凋亡分析;D.划痕实验;E.侵袭实验。

3 讨论

作为一种细胞外基质蛋白,SPON2具有募集炎症细胞、激活固有免疫应答等多种功能。近年来,在多种肿瘤中发现SPON2存在高表达,包括肝癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌[7-9]。本研究采用免疫组化和RT-PCR检测了114例ccRCC患者样本中SPON2的表达,发现SPON2蛋白和mRNA在ccRCC中的表达水平均高于癌旁组织,并且还发现SPON2的表达和肿瘤直径、肿瘤的临床分期和病理分级明显相关,提示SPON2的高表达可能与肾透明细胞癌的发生有关。肉瘤样改变被认为是高侵袭性ccRCC的一个特征。我们发现SPON2在伴肉瘤样改变的ccRCC中表达水平高于无肉瘤样改变的ccRCC。此外,在ccRCC转移患者肿瘤组织中,SPON2的表达升高,提示SPON2与ccRCC的转移潜能有关。

本研究发现Caki-1细胞中SPON2 mRNA和蛋白水平均高于786-0、HK-2细胞。但在786-0和HK-2细胞之间未发现上述差异。此外,敲除SPON2未能显著改变Caki-1细胞的体外增殖、集落形成和细胞凋亡,此结果不同于既往的报道[4,9]。我们推测SPON2在不同类型肿瘤中的功能存在差异。在本研究中,SPON2高表达与ccRCC转移密切相关,敲除SPON2可明显降低Caki-1细胞的侵袭和迁移能力。然而,Zhang等[7]的研究显示,过表达SPON2可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。因此SPON2在肿瘤细胞侵袭和迁移中的作用是复杂的,需要进一步的研究。

作为一项回顾性观察研究,纳入的患者数量相对较少,我们的结果可能不具有充分的代表性。SPON2在ccRCC中确切的作用机制还需要进一步的研究。综上所述,SPON2在ccRCC中表达增高,且与肿瘤直径、肿瘤分期、Fuhrman分级、肉瘤样改变和转移相关。敲除SPON2能够抑制ccRCC细胞的侵袭和迁移能力。

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