miR-506在结肠癌中的表达及其对结肠癌细胞自噬的影响

赵德余，王剑峰，郭 旭

(大连市中心医院肛肠科，辽宁 大连 116023)

结肠癌是发生于结肠部位的常见消化道恶性肿瘤，发病率在胃肠道肿瘤中占第3位，全球每年增加约90万新发病例和约50万死亡病例[1]。结肠癌好发于直肠与乙状结肠交界处，根据其病理特点可分为腺癌、黏液腺癌和未分化癌[2]，其中我国大部分患者为腺癌。结肠癌好发于40～50岁之间的人群，男女比例约为(2～3)：1[3]。目前临床对于结肠癌的治疗主要以外科手术切除和放化疗为主[4]，但治疗效果难以令人满意。因此，研究结肠癌的发病机理，寻找新的治疗靶点十分必要。

自噬是细胞的重要的生命活动之一，是细胞对于饥饿、细胞间压力、损坏细胞器和异常蛋白累积的一种应激处理，可使细胞在艰难环境中幸存下来，也可使细胞死亡[5]。有研究[6-8]表明，自噬在心血管疾病、癌症多种疾病中出现了异常，甚至，自噬还可促进肿瘤细胞对化疗药物的耐药[9]。自噬包括自噬信号转导、形成吞噬体、吞噬体移动变形、形成自噬小体、自噬小体与内体或溶酶体融合、形成自噬溶酶体、降解靶物等多个环节[10]，其中，miRNA在多个环节中发挥了重要的调节作用[11-14]。

结肠癌的发病机理是当前的研究热点，但miRNA和自噬与其发病和进展相关的研究尚未完全明了，本研究拟通过收集结肠癌患者的临床标本，检测其中miR-506的表达水平和自噬水平，并通过细胞实验进一步研究、验证，以期为结肠癌的发病机制提供新的研究思路，并为结肠癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2018年1—6月在大连市中心医院肛肠科就诊的74例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织标本，其中男55例，平均年龄(53.7±16.9)岁，女19例，平均年龄(55.8±14.2)岁，均经肠腔镜检和病理诊断确诊。

1.2 试剂与细胞

结肠癌细胞系HCT116、SW48、COLO225细胞均购自ATCC；RPMI-1640培养基购自Gbico公司；RNA提取及逆转录试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；胎牛血清和Lipofectamine 2000购自Ivitrogen公司；SYBR GREEN PCR Mix购自TOYOBO公司；miRNA荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技有限公司；miR-506 mimic、miR-506 inhibitor和miR-control均购自Sigma公司。

1.3 细胞培养

HCT116、SW48、COLO225细胞在37 ℃、5% CO2下用含有10%胎牛血清、1%的青霉素+链霉素的RPMI-1640的培养基进行培养，及时更换培养液，在细胞密度约80%时接种于6孔板，使用lipofectamine2000试剂盒分别转染miR-506 mimic、miR-506 inhibitor和miR-control，转染后6 h更换培养基，24 h后收获细胞进行检测。

1.4 RT-PCR检测Beclin1 mRNA表达水平

将收集的临床标本用剪刀剪碎，并加入液氮研磨收获细胞(若是细胞，则在收获后离心并用PBS洗涤后再离心去尽残液，加入液氮研磨)，制成单细胞悬液，用TRIzol法抽提总RNA，分光光度法进行定量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR GREEN试剂盒进行RT-PCR试验，其中miR-506的RNA的提取用小RNA提取试剂盒、cDNA的获得用加尾法miRNA cDNA第一链合成试剂盒、检测用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒。用2-ΔΔct法分析数据。引物设计见表1，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.5 Western blot检测Beclin1蛋白表达水平

将收集的临床标本用剪刀剪碎，并加入液氮研磨(若是细胞，则在收获后离心并用PBS洗涤后再离心去尽残液，加入液氮研磨)，制成单细胞悬液，用SDS Loading Buffer处理蛋白样品，处理好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转至PVDF膜，5% BSA在4 ℃封闭过夜，洗涤后37 ℃敷一抗1 h，再洗涤3次，在37 ℃敷二抗30 min，洗涤后显影。

1.6 统计学方法

表1 引物信息表

2 结果

2.1 miR-506 mRNA在结肠癌组织中表达上调

结肠癌患者癌组织标本miR-506、Beclin1的mRNA表达水平显著高于癌旁组织标本[(0.607±0.092)比(0.251±0.089)、(0.546±0.121)比(0.266±0.156)，t=23.995、12.203，均P<0.001]，而且二者的表达呈显著正相关(r=0.786、P<0.001)。见图1。

2.2 miR-506促进结肠癌细胞中Beclin1上调

培养HCT116、COLO225和SW48细胞，分别转染miR-506 mimic、miR-506 inhibitor或miR-control，采用RT-PCR检测Beclin1 mRNA在细胞中的表达，结果显示，在转染miR-506 mimic后，HCT116、COLO225和SW48细胞中Beclin1 mRNA的表达均显著升高(P<0.05)，在转染miR-506 inhibitor后，HCT116、COLO225和SW48细胞中Beclin1 mRNA的表达显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 结肠癌细胞系转染miR-506后Beclin1 mRNA表达水平比较

经Target scan分析发现，Beclin1的3′-UTR中存在可与miR-506互补结合的序列，这表明，Beclin1可能是miR-506的靶基因之一，见图2。

2.3 miR-506促进结肠癌细胞自噬

培养COLO225细胞，分别转染miR-506 mimic、miR-506 inhibitor或miR-control，采用Western blot检测细胞中p62、LC3B Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表达，结果显示，与转染miR-control比较，转染miR-506 mimic后，细胞中p62、Beclin1、LC3B Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.05)，LC3B Ⅰ蛋白表达显著下降(P<0.05)，即LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ转化增加，细胞自噬被促进；转染了miR-506 inhibitor后，细胞中p62、Beclin1、LC3B Ⅱ蛋白表达显著下降(P<0.05)，LC3B Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.05)，即LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ转化减少，细胞自噬被抑制。表明miR-506可促进COLO225细胞自噬。见图3。

3 讨论

结肠癌是一种恶性程度较高的消化道肿瘤，肥胖、吸烟、饮酒、年老和以肉食为主的饮食习惯都是结肠癌的危险因素[2]，大部分患者在患癌早期没有典型的临床症状，常规检查结果也少有异常，这就导致大部分患者确诊时结肠已有明显的恶性改变[15]。目前临床对于结肠癌的治疗以外科手术切除和放化疗为主，但治疗效果难以令人满意。

多种miRNA在结肠癌中表达发生变化，并参与结肠癌发病和进展[16]，有研究[17-18]报道，miR-193水平升高会抑制结肠癌进展，miR-143水平升高会抑制结肠癌细胞的增殖。本研究发现，在结肠癌中，miR-506的表达显著上调，这与上述研究有相互印证之处。本研究结果表明，在结肠癌中，miR-506与Beclin1的表达呈正相关，在结肠癌细胞系中发现miR-506可促进Beclin1的表达，而且经Target scan分析发现Beclin1与miR-506有序列可以互补配对，这表明，Beclin1可能是miR-506的靶基因，而且miR-506水平上升后，可能通过与Beclin1相结合，来促进其表达水平。

细胞自噬是细胞对内外微环境做出的一系列应激行为，对细胞的生存是一把双刃剑[19]。本研究表明，在结肠癌中，miR-506可促进LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ的转化，还可促进p62和Beclin1的表达，而可溶性p62的表达上升[20]、LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ的转化是细胞自噬活化的标志[21-22]，这就表明，miR-506可能促进结肠癌细胞的自噬。由于Beclin1是自噬环节中非常重要的调节蛋白，故miR-506可能是通过上调Beclin1实现对自噬水平的调节。

综上所述，笔者分析认为，miR-506可促进Beclin1的表达，并可促进结肠癌细胞的自噬，miR-506有作为结肠癌治疗靶点的潜力。当然，miR-506促进Beclin1表达的具体分子机制尚待进一步研究，miR-506对细胞自噬的影响也需要在动物模型中进一步验证，下一步的研究计划是通过分子生物学实验、细胞实验和动物实验进一步证实miR-506在结肠癌中的作用，以期为结肠癌的发病机制提供牢固的理论依据。