基于DNA 纳米结构的表面增强拉曼生物传感研究

吴彩骏， 杨 霞

（西南大学化学化工学院， 重庆 400715）

0 引言

散射光中除了与入射光频率相同的瑞利射线外，还存在与入射光频率不同并且强度较微弱的射线， 即拉曼（Raman） 散射。 Raman 现象自1928 年[1]被发现以来，拉曼光谱以其快速检测、样品要求少、无损分析以及优异的指纹特性等巨大优势，在化学和生物分析方面受到了广泛的关注。 但是由于大多数分子与光子作用的截面积仅有约10-30cm2，明显小于荧光截面，导致其拉曼信号微弱[2]，因此拉曼散射的强度只有入射光强度的10-10左右[3]。 不仅如此，拉曼散射对光源的强度以及单色性要求很高，同时还容易受到荧光或其他污染物质的干扰。 这种非常低效的拉曼散射严重限制了拉曼技术的发展。 直到上世纪60 年代，激光技术以及光电转换器件的问世为拉曼光谱带来了曙光， 自此拉曼散射的强度被提高，拉曼散射技术的应用也更加广泛了。

在1974 年，Fleischman 等[4]首次观察到粗糙银电极上吸附的吡啶分子具有较强Raman 散射信号。 1977 年， Jeamaire、 Van Duyne[5]和M. G.Albrecht、Creighton[6]等人验证了在粗糙银电极上，每个吡啶分子的Raman 信号平均增强了105～106倍。 这种当分子吸附在粗糙的贵金属材料表面（如金和银纳米材料）时，分子的非弹性光散射（即拉曼散射） 的程度会大大增强的现象被称为表面增强拉曼散射 （Surface-enhanced Raman Scattering，SERS）。1979 年，Creighton 等人发表了一篇关于Ag/Au 胶体表面SERS 的综述[7]，将金属胶体的尺寸、材料以及表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR） 的波长与SERS 效应相关联。他们证明金属胶体的SPR 效应会导致巨大的表面增强拉曼效应，将其称之为等离子体共振增强拉曼。 而且SERS 技术利用金属纳米结构成功地拓宽散射截面，从而增强少量样品的拉曼信号强度。

起初，SERS 作为一门小众学科，仅出现在拥有电化学和拉曼光谱两方面专业知识的科学家的视野中，当时在研究拉曼光谱前，需要对光学和激光领域有深入的了解。 1997 年，Shuming Nie等人通过SERS 技术探测了单个罗丹明6G 分子和单个纳米晶体， 证明了SERS 的信号强度非常灵敏，完全可与荧光相媲美[8]。近二十年来，SERS技术在纳米科学和纳米技术方面发展迅速，比如，SERS 活性纳米粒子的合成方法、纳米结构不同表面的制备方法以及表征所制备纳米结构的分析方法等。 如今，SERS 技术由于其无损微量检测，以及强大的指纹特性，现已广泛应用于痕量分子检测、 生物分子分析和材料表征等多个领域，并与电化学、催化、生物化学、高分子化学等多个学科联用，使得该技术在单一和多学科中的巨大潜力不断被开发。

1 表面增强拉曼散射增强机理

SERS 的增强机理主要包括物理增强 （电磁场增强）[9-11]和化学增强[12-13]。 其中，入射和散射光与金属纳米结构之间的相互作用（即电磁场增强 （electromagnetic enhancement，EM） 机制）是SERS 信号增强的主要来源。 首先，电磁波表面波可以在导电材料和介质之间的界面上广泛传播。激光作为电磁波（外部驱动力）的一种，可以激发金属中离域的自由电子（等离子体振荡）使其发生集体振荡[14]。 在金属纳米结构中，可以耦合传导电子振荡的电磁场振荡模式产生表面等离子体激元。 它们的特征是在金属表面处电场明显增强，而在纳米范围内远离表面时，电场矢量之和却呈指数衰减。 大多数SERS 活性基底是基于贵金属材料（金，银，铜等），一方面因为它们化学性质稳定；另一方面由于它们自身可以发生d-d 跃迁，使等离子体振动频率处于可见光区；最重要的是贵金属纳米材料可以支持表面等离子体激元。 这类能够支持表面等离子体的纳米材料称为等离子体材料[15]。它们的等离子体激元峰可以在可见光区域观察到，因此可被频率约1014～1015Hz的光激发而产生共振[11]。 在入射光共振激发时，入射激光辐射的振荡电场驱动金属表面自由电子发生振荡，导致其电荷分离[10,16]（如图1（a）（b）所示， 电磁辐射与不同金属纳米材料的相互作用）， 该过程可以有效增强分子所在位置的局部电场强度。 这种光的频率与集体振动的电子的共振频率耦合时，入射光与贵金属纳米结构相互作用， 使光有效集中于纳米结构表面狭窄的空间内， 金属纳米粒子表面的自由电子由此产生共振，使得周围的电磁场显著改变的现象称为局域表面等离子体共振 （localized surface plasmon resonance，LSPR）[17-19]。当金属表面的分析物分子被激发后，产生的拉曼信号会再次激发金属纳米结构的LSPR，经过多级激发，远程光谱仪接收到纳米结构局域内的分子的SERS 信号显著增强[20]。

图1 （a）电磁辐射与金属纳米球相互作用的示意图。（b）金属纳米棒中电子的横向和纵向振荡[10]Fig.1 (a)Schematic diagram of interaction between electromagnetic radiation and metal nanospheres.(b)Transversal and longitudinal electron oscillations in metal nanorods[10]

SPR 效应取决于很多因素， 比如粒子的形状[21]、尺寸和周围介质的性质等[17,22-23]。 研究表明，不同形状的纳米材料中，LSPR 被入射光激发后，其能量可以集中在纳米尺度的特征上（如边缘、尖端或缝隙），使局部电磁场强度大大提高。除此之外，在电化学粗糙电极表面等非优化系统中，由于纳米结构表面随机无序，其SERS 增强因子仅为105，而优化过的排列有序、形状规则的纳米粒子平均SERS 增强因子可达到107。因此具有等离子体特性的纳米材料极大地扩展了SERS 的应用[24]。

电磁场的强度与等离子体纳米材料的结构形态、空间排列、介电函数以及粒子间等离子体耦合等因素有关。 在等离子体材料的纳米尖端、粒子本身的纳米隙以及粒子间纳米隙周围存在高度局域化的电磁场，被称为SERS 热点[25-26]。它广泛存在于单个等离子体纳米结构、耦合等离子体纳米结构，与等离子体结构的杂化结构等具有不同性质的电磁耦合区域中[27]。 SERS 热点通过激发表面等离子体共振而产生，而且严重依赖于纳米环境的几何参数[28-29]。 但耦合纳米材料的间隙在EM 增强机制中所起的主导作用并没有被大部分SERS 研究者注意到。 直至1981 年，Metiu团队计算出了纳米球二聚体的局部场增强会随粒子间距离变化[30]。 1983 年，Metiu 团队计算了由一个金属球接近一个平坦的金属表面组成的结构的局部电磁场增强[31]。 这两个结果预测了Au或Ag 纳米粒子二聚体或带有纳米间隙的颗粒膜上的等离子体纳米结构将是增强SERS 的重要因素。 研究表明，金（银）纳米粒子二聚体和具有粒子间纳米隙的低聚体的间隙中存在很强局域电磁场[27,32]，它们的消光光谱和SERS 增强因子强烈依赖于间隙大小[14]。 F.Javier 等人证明了将金纳米球二聚体的间隙尺寸从10 nm 减小到2 nm时，SERS 的影响因子会从105增大到109[33]。图2中展示了不同的耦合等离子体纳米结构，电磁场增强主要集中在纳米间隙中的热点区域，这类材料具有优异的SERS 活性， 其SERS 平均强度比单一纳米结构高约4 个数量级。

在集中体系，纳米粒子彼此更接近，集体特性明显，相邻粒子之间的相互作用可以极大的增强SPR 效应， 从而获得高强度的SERS 信号[23]。SERS 技术由于超灵敏单分子检测， 已经成为鉴定、表征、检测、材料科学和生物分析的强大工具，SERS 拉曼峰的相对强度也被广泛用于研究被吸附分子的表面构型、电荷转移机制、等离子体介导的光催化等领域。

化学增强 （chemical enhancement，CM）[34-35]对SERS 的机理如下。 CM 机制包括：（1）基态相互作用，如表面络合作用或化学吸附引起的吸附质拉曼极化率增加，并非是共振增强；（2）类共振拉曼过程，这也有助于自由分子或表面络合物的拉曼极化率变化；（3）通过光子驱动的电荷转移，在主要具有金属性质的电子态和主要具有分子性质的电子态之间产生新的共振；（4） 在极负的施加电压下，由于分子的溶剂化而使静态或动态极化率增大，从而产生富电子的电化学界面。 因此，SERS 的化学增强强烈依赖于分子/物质之间的相互作用反映在光电场中电子密度形变的难易程度， 以及被分析物在基底表面的特定位置。然而，这两种增强机制都需要被分析物分子靠近等离子体表面。因此，将EM 增强和CM 增强机制相结合，对于SERS 实现超痕量检测至关重要。

2 表面增强拉曼散射的基底

SERS 中使用的理想等离子体纳米结构通常被称为SERS 基底，这类材料一般化学稳定性好，不仅容易重复制备，而且表现出较好的空间均匀性，最重要的是有较高的SERS 增强因子。

（1）金属纳米材料基底

目前SERS 基础研究中， 贵金属材料被广泛应用于实践，其中最常用到金和银纳米材料。 因为用波长短能量高的激光激发时，其自身拥有的离域电子在不同能量范围内发生带内和带间跃迁而发生LSPR，使SERS 极大增强[37]。 经过总结，制备具有较强局域电磁场等离子体纳米材料以及拥有丰富热点的SERS 基底是增强SERS 信号的关键。 研究者发现，金属纳米粒子的形貌和尺寸以及空间结构和排列形式对等离子体特性具有非常大的影响。

由于不同形貌和尺寸的纳米粒子具有各向异性， 特别是那些具有尖锐尖端和边缘的材料，有利于实现更大的电磁场增强。 研究者利用一锅法合成金纳米花，实现了对miRNA 155 的超灵敏检测[38]。 金纳米花不仅具有较大的表面积，而且由于具有锋利的花瓣而集中电荷来增强电磁场，而且花瓣之间会存在纳米空腔，可以极大的增强LSPR。 Li 等[39]制备了金纳米立方体，用于谷胱甘肽的灵敏定量检测，通过立方块的面之间相互耦合，形成“热面”，来增强SERS 信号。Xu 等[40]利用超声聚集诱导法富集金纳米棒，利用纳米棒聚集后产生的热点来增强SERS 信号。 除了单一金属的纳米材料，研究者还制备了不同形貌的金/银纳米复合材料，并将拉曼分子放置在金银纳米缝隙中，利用纳米粒子内部的相互耦合，极大程度的增强LSPR，提升SERS 效应。Ma 等[41]将罗丹明B分子嵌入Au/Ag/Au 杂化纳米结构的第一个纳米间隙（宽度～1.9 nm）中，并通过添加多层纳米间隙进一步提高了SERS 信号。除此之外，研究者还利用种子介导法制备了不同形貌，不同尺寸的金银纳米材料（例如三角纳米板[42]，纳米岛[43]，金银杂化哑铃状纳米结构[41]）来制造纳米隙或纳米空腔，以此来增强电磁场，增强SERS 信号。

除此之外，不同维度（零维、一维、二维和三维）的贵金属都可以作为SERS 基底。因为金属表面之间的纳米间隙能产生丰富的有效热点，尤其是当间隙降低到1 nm 以下时，金属的LSPR 效应表现更加明显，SERS 的信号将被放大多个数量级。 零维纳米颗粒就是分散在溶液中而独立存在的纳米粒子。 一维金属纳米粒子阵列是利用相邻纳米颗粒结合，产生热点，是局域电磁场增强，例如金纳米球二聚体（如图2（a））等。二维金属纳米粒子阵列主要应用于无序纳米粒子。 该法通过物理或化学作用，使无序的纳米粒子以密集有序的方式排列时，由于集体特性使等离子体共振更明显，而这种结构的热点区域在比表面的分布密度可以最大化，从而提供额外的拉曼增强。 此外，由于减少了损耗（延迟或阻尼效应），二维周期阵列的电磁场效应可以比无序金属纳米颗粒薄膜高几个数量级。 目前已经有多种制备二维周期阵列的方法，例如，刘洪林教授课题组[44]利用界面能下降在水油两相界面上自组装了单层二维金纳米球， 这种SERS 基底可以快速捕获农药分子并定位到等离子体热点区域。 三维金属纳米粒子阵列，可以在三维模板上修饰金属纳米粒子或者形成其他更复杂的组装体， 这些三维SERS 基底为目标分析物的吸附提供了较大的比表面积，并在激光照明区域内提供了密度较大的热点。 Liu等[45]利用水包油的软模板法合成了三维银纳米胶来增强SERS 信号。 这类三维材料虽然单个组装体热点密集，但依然面临固体基底的团聚度及咖啡环效应的难题。

图2 耦合纳米粒子中的热点区域，以及金纳米粒子SERS 增强分布的有限元仿真模拟（FEM）。 （a）纳米球二聚体，（b）纳米立方体二聚体，（c）Au@SiO2 核壳纳米球二聚体，（d）Au@Pt 核壳纳米球二聚体。 （e）金纳米颗粒聚集物（左）和低聚物（右）。 （f）金核卫星纳米结构（左）和金纳米棒垂直自组装（右）。 （g）将Ag 沉积在预组装的SiO2 或聚苯乙烯球上，制备的纳米凸起（左）或纳米空阵列（右）。 （h）纳米七聚体（左）和纳米锥四聚体（右）。 在（e-h）中，白点为吸附拉曼信号分子。 （a-d）引用自文献[27]，（e-f）引用自文献[36]Fig.2 Hot spot regions in coupled nanoparticles,and finite element simulation(FEM)of the SERS-enhanced distribution of gold nanoparticles.(a)Nanosphere dimer,(b)nanocube dimer,(c)Au@SiO2 core-shell nanosphere dimer,(d)Au@Pt core-shell nanosphere dimer.(e)Gold nanoparticle aggregates(left)and oligomers(right).(f)Gold core-satellite nanostructures(left)and gold nanorod vertical self-assembly(right).(g)Nanobumps(left)or nanohollow arrays(right)prepared by depositing Ag on pre-assembled SiO2 or polystyrene spheres.(h)Nanoheptamer(left)and nanocone tetramer(right).In(e-h),the white dots are adsorbed Raman signal molecules.(a-d)cited by ref[27]，(e-f)cited by ref[36]

在实践中，金纳米材料最为通用，因为它具有更好的生物相容性，化学性质更稳定，不易被氧化，以及更广泛的可用纳米颗粒形状。 而银纳米材料增强效果显著， 但因其不稳定性而受到局限。

除此之外， 过渡金属也在SERS 基底材料中崭露头角，但其增强效果欠佳，该材料常包裹在Au NPs 表面，形成核壳结构来改善自身SERS 增强信号[46]。现在，越来越多的金属、金属氧化物以及金属杂化纳米材料作为SERS 增强基底， 被应用于催化、生物标志物检测和医药临床等领域。

（2）半导体材料基底。 近年来，研究者发现一些半导体衬底表现出优异的SERS 效果， 这主要是依赖于衬底与被吸附分子之间的化学相互作用（CM 机制）[13,47]。 与贵金属基底相比，半导体基底对被测物分子表现出很强的选择性，可以选择性地增强非完全对称的振动模式[12,48]。

由于纳米科学和纳米技术的迅猛发展，很多研究者开始关注半导体增强拉曼散射，并制备了多种半导体材料SERS 活性基底， 例如金属氧化物，金属硫化物，金属碲化物等。 常见的半导体基底有：二氧化硅[49]，主要用于促进干涉增强拉曼散射和制造SERS 波导和微透镜； 二氧化钛[50]，因为它具有高化学稳定性，高折射率，多功能表面功能化，与等离子体纳米粒子的协同耦合以及优异的生物相容性被用于生物传感和药物分析；氧化锌[51]，该纳米材料由于表面存在缺陷能级，可以使电荷转移到分子的未占据态，从而导致了完全对称和非完全对称模式的出现， 可以增强SERS 信号。 这也表明富集的缺陷态可以有效地促进电荷转移通道和振动耦合，从而产生了较强的SERS 效应；其他还有NiO[52]，CuO[53]，V2O5[54]，ReO3[55]，WxOy[56]，ReS2[57]等半导体材料均被应用于SERS 基底。 虽然SERS 的CM 增强机理还未完善， 但它仍然为如何构建基于半导体的SERS传感器提供了基础， 而且半导体继承了SERS 的分子特异性和原位分析能力等优点，已经被用于一些有前景的应用。

（3）其他纳米材料基底。例如，石墨烯，MOFs，聚集诱导有机物，硫化物和杂化纳米材料（如金属/半导体[58]、金属/石墨烯[59]、金属/MOFs[60]等）。许多新型等离子体纳米材料 （可用EM 机理解释）可通过调整纳米材料的尺寸、形状、空间组织、纳米粒子自组装和性质等，实现更好的电荷转移或更好地约束电场，从而诱导SERS 增强。新型非等离子体纳米材料 （可用CM 机理解释）能够更好地促进原子缺陷引起的电荷转移，从而实现SERS 增强，而且这类材料可以解决金属和半导体无法解决的部分问题， 例如石墨烯对荧光染料[61]（罗丹明，甲苯胺蓝等）具有显著的猝灭作用，这很大程度上消除力荧光对拉曼的干扰。 这类材料扩展了SERS 在材料和生命科学方面的应用。

3 表面增强拉曼散射基底的制备方法

研究者近二十年来探究了很多制备SERS 基底的方法，总体可以分为自上而下策略和自下而上策略，这里介绍几种典型制备方法。

常见的自上而下制备方法有：（1） 将含纳米粒子的溶液滴在硅片等固体基质上，干燥后使其固定化。 因为该法操作简单，检测快速而被研究者广泛应用。 但直接沉积的纳米粒子通常不会均匀分布，常出现咖啡环效应[62]，即干燥后的液滴边缘有明显的堆积物质。 该方法制备的SERS 基底最大的问题在于被测物分子的重现性欠佳，通常需要引入比率法辅助降低背景信号。 （2）利用原子层沉积[63]（如图3 所示），电沉积，喷溅沉积等沉积技术将等离子体纳米颗粒沉积在硅、石英、多孔氧化铝等表面上来制备SERS 基底。该方法可以应用于多种表面，可以将等离子体纳米材料以单层膜/多层膜的形式均匀的镀在基底上，使其紧密排列， 增强材料的SPR 效应， 从而增强SERS 信号。 但不足之处在于该法强烈依赖相关高性能仪器，大大限制了它的使用。 （3）模板法，为纳米材料的生长提供生长一种主题构型，从而控制SERS 基底的均匀程度。 这类基底中纳米粒子之间的间距一般都比较大。 （4）刻蚀法，是一种利用化学或物理方法，选择性去除材料表面的方法，例如采用氧等离子体刻蚀法对聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）静电纺丝纳米纤维进行修饰，以促进银纳米粒子（Ag NPs）的生长，并将表面镀银纳米粒子的PMMA 纳米纤维作为表面增强拉曼散射（SERS）的活性衬底[64]（如图4 所示）。 这类基底在可控层次结构方面有突出优势。 （5）纳米光刻技术，是一种高度灵活的纳米制造方法，它可以控制纳米粒子的大小、形状和粒子间距，使最简单的结构形成单层周期粒子阵列。 在LSPR 激发下，金属尖锐的尖端导致电磁场增强。 其他还有许多制备方法， 例如组装聚合物/纳米粒子，纳米阵列，金银纳米球二聚体等。

图3 不同形式的原子层沉积的单层SERS 基底[63]Fig.3 Different forms of atomic layer deposition of monolayer SERS substrates[63]

图4 （a）Ag NPs 在PMMA 纳米纤维上的示意图；（b）PMMA 薄膜（上）和Ag NPs 附着在PMMA 薄膜（下）的照片；（c），（d）是Ag NPs 修饰在PMMA 纳米纤维膜前后的SEM 图[64]Fig.4 (a)Schematic diagram of Ag NPs on PMMA nanofibers.(b)Photographs of PMMA film(top)and Ag NPs attached to PMMA film(bottom).(c),(d)SEM images of Ag NPs modified in PMMA nanofiber membrane before and after,respectively[64]

常见的自下而上制备方法有：（1） 液液界面自组装。 可以在液相种自组装的材料通常是在溶液中静电平衡且动态稳定，或者对界面具有可逆亲和力，或者具有可以共价结合的表面配体的纳米粒子[65]。 而溶液中的纳米粒子是亚稳态的，可以长时间稳定悬浮在溶液中，但在储存或使用过程中，它们会溶解、聚集或沉淀，这会影响纳米粒子潜在的等离子体特性和SERS 基底增强。 因此，可以将不同性质的配体有效地修饰纳米粒子的外表面，改变纳米粒子的溶解度以及静电作用力，精准调控纳米粒子之间的距离，消除其形成界面时的阻碍力，指导纳米粒子的自组装。 设计合理的SERS 增强基底和纳米粒子界面稳定性时，需要考虑粒子间相互作用以及界面的范德华力、静电力、溶剂张力和表面配体的协同贡献[66-67]。 由于液相界面纳米颗粒阵列的均匀性远优于溶胶中的随机聚集以及固体表面上的固定阵列， 这类自组装界面可以形成多层次有序结构，集体特性明显，等离子效应较强，有很好的SERS 增强效果。 而且界面高度有序的纳米颗粒阵列更方便、成本更低，同时具有可变性和通用性， 可以确保分析物分子集中在纳米间隙中，界面阵列上的液相SERS 正在成为一种有前途的传感平台。 Lu 等[68]报道了一种简单有效的化学交联策略， 在Au NPs 表面修饰可聚合分子丙烯酰胺，通过丙烯酰胺的光聚合，在空气-水界面上制备大规模单分子层金纳米粒子薄膜，其尺寸可智能调节，而且易于转移（如图5 所示）。 Gurunatha等[69]报道了一种使用专门设计的刚性的且具有超强亲和力的α-Rep 蛋白对，以它们与金纳米粒子的结合驱动了大量独立的单粒子厚膜的胶体定向组装。 而且这些组装后的聚集物可以通过自由蛋白质的结合可逆地分解。 该方法可应用于生物传感、细胞靶向或功能纳米材料工程（如图6）。

图5 大面积交联单层膜的光学、SEM 和TEM 图片。 （A）-（D）紫外灯照射前，丙烯酰胺未聚合的界面，（E）-（H）紫外灯照射后，丙烯酰胺聚合的界面[68]Fig.5 Optical,SEM,and TEM images of large-area cross-linked monolayer films.(A)-(D)Unpolymerized interface of acrylamide before UV lamp irradiation.(E)-(H)The interface of acrylamide polymerization after ultraviolet lamp irradiation[68]

图6 由竞争蛋白作为刺激物诱导α-Rep 蛋白对的分解过程的示意图和透射电镜图像[69]Fig.6 Schematic diagram and transmission electron microscope images of the catabolism of α-Rep protein pairs induced by competing proteins as the stimulus[69]

（2）聚合物制备柔性基底法。Sun 等[70]利用白砂糖和软白糖作为成孔试剂，制备了一种多功能的聚二甲基硅氧烷（PDMS）海绵，并借助3-巯基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）在PDMS 海绵上进行多次Ag NPs 沉积，实现SERS 增强，用于检测表面和溶液中的农药残留。 Zhang 等[71]用PDMS印章转移单层纳米颗粒，并利用金蚀刻剂逐层蚀刻印在硅基板上的金纳米粒子膜， 形成高效、均匀的多层表面增强拉曼散射（SERS）基底，系统地研究了纳米粒子层数和蚀刻时间对SERS 基底性能的影响。 研究表明，使用自下而上的化学方法可以实现低成本、大规模、均匀、高增强因子、低检测限的SERS 基底。

4 DNA 技术在表面增强拉曼传感器中的应用

DNA 除了作为遗传信息载体和将遗传密码翻译成蛋白质的核心角色外，还常被用于组装界面结构，构建纳米结构，或者将寡核苷酸探针与被分析的DNA 或RNA 靶点杂交。最简单的DNA杂交方式是双螺旋DNA 双链刚性结构， 它的形成是基于Watson-Crick 碱基对互补原则[72]，由腺嘌呤（A）—胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）-鸟嘌呤（G）碱基对间形成氢键而组成。 现在，DNA 技术在生物分析、DNA 计算、DNA 纳米技术和纳米医学等方面都有广阔的应用。 DNA 在SERS 生物传感器中的应用主要集中于核酸信号扩增技术，和DNA 与纳米材料可预测的组装。

4.1 基于DNA 核酸信号扩增策略

近年来，高灵敏和特异性的核酸检测在传染病诊断、microRNA 检测以及生物医学研究等领域应用广泛。 核酸检测一般是通过预先设计用来结合被测目标核酸的互补片段—寡核苷酸信号探针，然后利用对探针的信号的采集，间接检测目标物。 为了降低目标物的检测限（LOD），研究者设计了不同信号放大策略，将探针或目标物进行多次循环， 使探测器获得放大的被测物信号。最初研究者设计了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）[73]， 它可以很好的降低DNA检测的LOD。然而，它需要昂贵的热循环器，这限制了它在核酸实际检测中的应用。 随着DNA 技术的发展逐渐成熟，研究者发现，可以在恒温条件下进行生物标记物扩增检测的等温扩增技术，因其操作简单、检测快速、类似PCR 的灵敏度、低成本和高能源效率而迅速成为PCR 技术的替代方法[72]。等温扩增技术又分为无酶扩增和酶促反应。 常用的目标物信号无酶扩增技术有（1）链置换扩增 （strand displacement amplification，SDA）。SDA 反应可以在靶标结合后扩增短靶标识别序列，例如适配体，可与生物传感器结合进行分析检测。 （2）催化发卡自组装反应（catalytic hairpin assembly，CHA）。 CHA 作为一种无酶信号增强循环反应， 通过两个DNA 发夹结构在等温条件下的杂交和置换， 可以将目标物信号放大数百倍。但由于DNA 发卡之间的非特异性反应， 导致较高背景信号。 （3） 熵驱动DNA 链置换（entropy drives DNA strand replacement）反应，是通过熵增驱动的，而不是由新碱基对形成所释放的自由能驱动的无发夹信号扩增策略。 这是一种独特的驱动力，在放大过程中，系统的吉布斯自由能保持不变，而且不受酶的干扰，系统中的特异性反应减少， 为准确检测目标物提供了更可靠的平台。如图7 所示，谭蔚弘院士课题组[74]报告了一种基于分子工程的、熵驱动的三维DNA 放大器，它可以实现对活细胞内特定的mRNA 目标物的超灵敏检测。 除此之外，还有滚环扩增反应，杂交链式反应等方法应用于核酸链式杂交循环来实现目标物信号放大。 但由于无酶反应有一定的非特异性反应而导致背景信号较高，所以酶催化的级联放大 （enzyme-catalyzed cascade amplification）反应进入了人们的视线，利用链置换聚合酶、核酸外切酶、核酸内切酶、切口酶、或双特异性核酸酶等对目标物进行循环， 提高检测灵敏度。 但在SERS 生物传感器中， 酶这类生物大分子会在吸附在基底材料上而阻碍基底的SERS 增强， 影响目标物的信号。 因此，信号放大策略在传感器的实际应用中常使二者结合，经过了精心的设计和优化，来降低核酸分子检测的LOD。近几年，许多课题组成功构建了很多基于核酸扩增技术的SERS 生物传感器，实现了对多种的生物标志物，miRNA 及金属离子的灵敏检测。核酸扩增技术已经广泛应用于智能构建现代光学纳米生物传感器（例如荧光、SERS、电化学发光和SPR 等）中。

图7 （a）熵信标四面体的构建和（b）燃料四面体的构建；（c）熵驱动的3D DNA 放大器催化放大信号增强特定mRNA 表达的机制[74]Fig.7 (a)Construction of the entropy beacon tetrahedron module and(b)the fuel tetrahedron module.(c)Mechanism of entropy-driven 3D DNA amplifier catalyzed amplification signal to enhance specific mRNA expression[74]

4.2 基于DNA 结构的纳米材料自组装

由于等离子体在金属表面附近的局域表面等离子体共振效应可以产生各种新奇的现象和特别的应用，因此它的研究在光学领域中占据的位置越来越重要。 而DNA 核酸序列利用分子自组装、碱基配对的特异性识别，可逆结合以及末端可灵活修饰的优势[75]，不仅可以使有机分子在纳米级别精密自组装，而且可以精确调节无机纳米粒子在空间中的排列及间距。 因此，越来越多的研究者利用自组装的DNA 纳米结构作为支架来创建高级等离子体结构，并探究这类材料在光学功能的应用。

当两个金属纳米粒子之间的距离不同时，它们的等离子体激元共振程度不一样，从而会导致其SERS 信号的改变。 这是由于金属纳米粒子的等离子体共振强烈依赖于周围介质的影响。 在SERS 传感器中，DNA 结构的作用可以总结为两种：（1）通过DNA 杂交调控拉曼分子与活性基底的距离，以此改变SERS 信号。前文提到金属表面的LSPR 效应会随着距离（纳米范围）增加而指数下降，而发卡型DNA 可以一端修饰巯基（或者氨基等）固定在金（或银）纳米颗粒上，另一端修饰拉曼分子，当DNA 发卡结构保留时，拉曼分子贴近SERS 活性基底表面而有强的拉曼信号。 当体系中存在与发卡DNA 互补的核酸链时， 刚性的DNA 杂交双链代替发卡结构，使拉曼分子在纳米层面远离基底而SERS 信号降低[76]。 除此之外，还可以通过精密调控核酸链的碱基数或不同的DNA 结构，来调控拉曼分子与基底之间的具体距离。 （2）通过DNA 结构对等离子体材料的组装，制备具有集体特性的SERS 基底。 DNA 自组装对纳米粒子的间距和由此产生的间隙大小具有优异的控制功能。 制备DNA 组装的等离子体纳米结构一般依赖于金属纳米粒子的功能化， 例如，末端修饰巯基的DNA 可以通过金-硫化学键功能化Au NPs， 末端修饰氨基的DNA 可以通过氨基与羧基交联，功能化Ag NPs、柠檬酸盐还原的Au NPs 以及其他有机材料。 如图8 所示，Fan 等[77]利用DNA 互补的特性，将四个金核壳纳米材料聚集成环状结构， 并通过他们的LSPR 吸收峰模拟了该四聚体的磁共振形成，最终证明该四聚体具有较强的SPR 效应。 而且DNA 结构组装的纳米材料可以通过DNA 的可逆性结合和释放，对这类具有集体特性的等离子体选择性增强或减弱。 但环境的温度，溶剂蒸发以及其他表面效应会导致原本固定的DNA 双螺旋变形甚至解旋，从而潜在地影响设计的等离子体效应，因此在设计过程中需要仔细考虑和进一步研究。

图8 （a）硫代DNA 功能化的纳米壳与金纳米球结合，可形成密实的五聚物结构的TEM 图像。 （b）具有类法诺共振的五聚体的两种模式的消光光谱和表面电荷示意图[77]Fig.8 (a)Thio-DNA functionalized nanoshells combined with gold nanospheres to form dense pentamers.TEM image of the structure.(b)Schematic diagrams of the extinction spectra and surface charges of the two modes of heteropentamer with Fano-like resonances[77]

DNA 纳米技术为等离子体的组装方式带来了前所未有的研究方向。 这种耦合效应不仅提高了结构稳定性，减少了粒子间距离，还对特性等离子体组合的发现产生了深远的影响。 这种利用DNA 功能化的纳米材料自下向上组装方式，可以打破许多传统制造SERS 基底方法的限制， 推动了纳米光子学的发展。

因此， 通过将SERS 策略与DNA 技术相结合， 可以极大程度的改善SERS 技术的稳定性和重现性，构建具有突出稳定性能的可高效高灵敏检测生物分子的SERS 传感平台。

5 结论

SERS 生物传感器与荧光、电致化学发光、以及电化学生物传感器相比，有突出的优势，不仅制备过程简单，而且生物相容性好，灵敏度高，最终重要的是可以无损检测，这非常有利于细胞内生物标志物的检测。但由于SERS 技术过于灵敏，极容易察觉到周围环境的变化，而生物传感器中往往牵涉到复杂的生物系统，比如不同DNA 链，酶，缓冲液，两相溶剂等，这往往会改变等离子体材料表面的电场，有时甚至会干扰拉曼分子的检测。 因此，在往后的研究中，需要重点关注和克服其他分子结构对基底材料的影响。 除此之外，很多拉曼分子常常伴随荧光现象而对SERS 检测结果造成干扰。 虽然金纳米材料对荧光具有猝灭作用，但该作用依然受到材料尺寸的约束；半导体材料也只有与被测分子发生有效的电荷转移时才能猝灭荧光。 因此，需要制备不同结构的SERS活性基底，从原理上减弱荧光干扰。 合理设计更多性能优良的SERS 基底， 实现SERS 技术重现性和灵敏度双提升， 使SERS 传感器可以广泛应用在生物，医学，临床等领域。