隐丹参酮增强胆管癌吉西他滨化疗敏感性

周功挺，王继生，陈亦明，洪重，廖毅

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 肝胆外科，浙江 温州 325027）

以吉西他滨（gemcitabine，GEM）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）为基础的两大类方案对治疗胆管癌延长生存时间取得了一定的效果，但对抑制肿瘤的复发及进展作用有限，且不良反应较大，目前GEM耐药已成为导致其疗效不佳的重要原因[1-2]。 缺乏有效敏感的化疗药物及合理的化疗方案是胆管癌综合治疗的瓶颈。JAK/STAT3在机体的生长发育和稳态过程中发挥重要作用，但其在肿瘤中的激活影响细胞增殖、侵袭、上皮-间充质转变和血管生成的多种信号通路，被认为是肿瘤治疗的靶点[3-5]。研究结果表明隐丹参酮是一种有效的STAT3抑制剂，可有效抑制STAT3 Tyr705磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的生长[6-8]，可增强紫杉醇对舌鳞癌细胞毒性作用[9]，逆转人肺癌A549细胞顺铂耐药等[7]。

然而，目前仍不清楚隐丹参酮是否能增强胆管癌吉西他滨化疗的作用。因此，本研究探讨隐丹参酮与吉西他滨联合用药对胆管癌QBC939细胞株的体外凋亡及周期的影响，并探讨STAT3在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：胎牛血清、RPMI-1640培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒、RIPA缓冲液等免疫印迹试剂购自上海碧云天公司；吉西他滨购自美国礼来公司；隐丹参酮粉剂（批号：S228530）购于美国Selleck公司，纯度＞99%，溶于DMSO中，配制成10 mmol/L 的储存液，于-20 ℃保存，使用时稀释至所需浓度。

1.1.2 抗体：STAT3、pSAT3抗体购自美国CST公司，Bcl-2、Bax购自英国Abcam公司，cyclin D蛋白抗体购自武汉三鹰公司，β-actin抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人胆管癌QBC939细胞（购于中国科学院上海细胞生物学研究所）培养在37 ℃、5%的CO2培养箱中，10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，每3 d换液1次。细胞单层贴壁生长，约80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 CCK-8法检测细胞生长抑制率：收集处于对数生长期的胆管癌QBC939细胞，制成单细胞悬液， 以细胞数4×103/孔分别接种到96孔板。细胞贴壁 后，分别加入用完全培养基配制的连续浓度的隐丹参酮处理（0、10、20、30、40和50 μmol/L），分别加 入用完全培养基配制的连续浓度吉西他滨100 μL（分 别为0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/mL），持续24和48 h。药物作用结束前1 h，各孔加入0.01 mL的CCK-8，继续培养1 h，酶标仪（Bio-Tek，ELX800）测定吸收度（A450），实验重复3次。计算生长抑制率＝[1-药物组A570 nm/对照组A570 nm]× 100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率：根据试剂盒使用说明书进行操作。隐丹参酮和吉西他滨的实验浓度参考CCK-8实验确定的48 h的IC50。经对照组培养基、隐丹参酮20 μmol/L、吉西他滨2 μg/mL及联合用药组（隐丹参酮10 μmol/L+ 吉西他滨1 μg/mL）处理24 h后，调整待测细胞数为1×105个/mL，取1 mL于1 000 r/min共离心5 min，弃去上清液，用PBS漂洗1次后，加入Annexin V binding buffer 500 μL混匀，制成单细胞悬液，再分别加入Annexin VFITC和PI染色液各5 μL，轻柔混匀，室温下避光孵育15 min，1 h内上流式细胞仪检测。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：收集处于对数生长期的QBC939细胞，经对照组培养基、隐丹参酮 20 μmol/L、吉西他滨2 μg/mL及隐丹参酮10 μmol/L+ 吉西他滨1 μg/mL处理48 h后，RIPA裂解液各组细胞，提取上清液，BCA法测定蛋白浓度。每孔蛋白上样量为20 μg，8% SDS-PAGE电泳，电泳结束后以250 mA恒流将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后滴加兔抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax、JNK、STAT3、p-STAT3（Ser727）抗体为一抗，再加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5 000），37 ℃孵育1 h；ECL显色，电化学发光法显影。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以表示，多组间比较采用析因设计的方差分析，组内两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮及吉西他滨对胆管癌QBC939细胞增殖的抑制作用 CCK-8法检测结果显示，0、10、20、30、40、50 μmol/L隐丹参酮分别作用24、48 h，均能明显抑制胆管癌QBC939细胞的生长，且随着浓度的增加及时间的延长，隐丹参酮对胆管癌QBC939细胞增殖的抑制率增加。同法，CCK-8法检测结果显示，0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/mL 吉西他滨分别作用24、48 h，胆管癌QBC939细胞增殖存在抑制作用，见图1。

2.2 隐丹参酮及吉西他滨对QBC939细胞凋亡的影 响 与对照组比较，隐丹参酮、吉西他滨作用24 h对胆管癌QBC939细胞有显著的诱导凋亡作用。在QBC939细胞中，隐丹参酮组、吉西他滨组及联合用药组的细胞凋亡率分别为（19.80±0.92）%、 （24.20±0.56）%和（35.40±1.57）%，均明显高于对照组的（8.84±0.58）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合用药组高于隐丹参酮组及吉西他滨组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 CCK-8法检测不同浓度隐丹参酮、吉西他滨对胆管癌QBC939的生长抑制率

图2 隐丹参酮、吉西他滨及两者联合用药对QBC939细胞凋亡的影响

2.3 隐丹参酮、吉西他滨及两者联合用药对QBC939细胞中Caspase凋亡通路及JAK2/STAT3通路的影响 对照组、隐丹参酮组、吉西他滨组及联合用药组作用48 h后，Western blot检测胆管癌细胞中蛋白Active Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达，结果显示隐丹参酮单独用药、吉西他滨单独用药或两者联合用药后，胆管癌QBC939细胞中的Bcl-2的表达下降，Active Caspase-3及Bax的表达均升高，表明此时细胞中Caspase凋亡通路已被激活；经隐丹参酮单独用药、吉西他滨单独用药或两者联合用药后，胆管癌QBC939细胞中的p-JAK2及p-STAT3（Ser727）蛋白表达水平下降，联合用药与隐丹参酮单独用药相比Bcl-2、p-JAK2及p-STAT3（Ser727）水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05），Active Caspase-3及Bax蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），联合用药与吉西他滨单独用药相比Bcl-2、p-JAK2及p-STAT3（Ser727）表达水平下降，Bax蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

3 讨论

胆管癌是第二常见的肝癌类型，是由胆道系统上皮细胞引起的恶性肿瘤，是治疗最困难的腹腔内癌症之一，具有高度的侵袭性，不可切除或术后复发转移的胆管癌预后极差。OKUSAKA等[10]研究表明单药吉西他滨治疗疗效有限并具有一定毒性，寻找一种增加吉西他滨的疗效且降低其不良反应的药物具有重要意义。本课题组前期研究发现隐丹参酮对胰腺癌细胞的增殖、迁移等均有明显抑制作用。

图3 Western blot检测隐丹参酮、吉西他滨及两者联合用药作用48 h后对QBC939细胞中Active Caspase-3、Bcl-2、Bax、JAK2及STAT3磷酸化蛋白的表达情况

隐丹参酮作为丹参的主要活性成分之一，有研究表明隐丹参酮具有显著的抗肿瘤作用[4-5，11-12]。隐丹参酮可通过激活Caspase凋亡通路诱导卵巢癌A2780细胞的凋亡，并抑制卵巢癌A2780细胞的迁移和侵袭[13-14]。本研究中通过隐丹参酮（0、10、20、30、40和50 μmol/L）处理QBC939细胞，应用CCK-8法检测发现隐丹参酮能够明显抑制QBC939细胞的增殖并诱导细胞凋亡。本研究利用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡，结果发现隐丹参酮 （10 μmol/L）联合吉西他滨（1 μg/mL）对QBC939细胞的抑制作用均大于隐丹参酮（20 μmol/L）和吉西他滨（2 μg/mL）单用，存在较强的协同效应。

我们发现隐丹参酮能抑制胆管癌QBC939细胞的JAK2及STAT3的磷酸化。研究表明隐丹参酮可抑制舌鳞癌CAL27细胞的STAT3的磷酸化，舌鳞癌CAL27中STAT3磷酸化的抑制导致STAT3下游靶蛋白 （survivin、cyclin d1和Bcl xL）的表达下调[9]。类 似的研究表明隐丹参酮可通过阻止STAT3信号通路的激活，抑制结肠癌和肾癌的生长，并诱导其凋亡，表明隐丹参酮是一种有效的STAT3抑制剂[15-16]。 吉西他滨也存在抑制STAT3磷酸化的作用[17-18]。Western blot检测结果显示，隐丹参酮单药或协同吉西他滨能够显著抑制p-JAK2和p-STAT3的表达，进而减少抗凋亡蛋白Bcl-2和上调凋亡蛋白Active Caspase-3。由此推测，STAT3信号通路的抑制可能与隐丹参酮增强吉西他滨在胆管癌QBC939细胞抗肿瘤作用有关。

综上，本研究表明隐丹参酮具有潜在的临床治疗胆管癌的价值，联合吉西他滨具有协同作用，其机制可能与STAT3信号通路相关。