短暂性和永久性脑缺血大鼠对侧小脑代谢变化

夏能志，胡子龙，黄群，郑宏，高红昌，杨运俊，李建策

（1．温州医科大学附属第一医院 放射影像中心，浙江 温州 325015；2．温州医科大学 药学院 代谢组学与医药核磁共振研究所，浙江 温州 325035）

目前采用短暂性或永久性大脑中动脉闭塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立局灶性脑缺血模型，是开展缺血性脑血管病实验研究的重要基础[1-3]。有研究表明，短暂性MCAO（tMCAO）和永久性MCAO（pMCAO）模型在幕上大脑组织神经元损伤、炎症、氧化应激、代谢等方面存在差异，但针对幕下小脑的相关研究尚少[4-5]。研究发现，幕上局灶性脑损伤后可引起对侧小脑出现继发性的功能改变，表现为对侧小脑血流量减少和代谢减低[6-8]。本研究应用基于核磁共振氢谱（1H NMR）的代谢组学技术探讨tMCAO和pMCAO大鼠对侧小脑的代谢变化，为脑缺血的早期诊治提供准确的生物化学信息。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 选取64只健康雄性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），清洁级，体质量250～320 g。适应性饲养1周后分为对照组（CON，n=12）、pMCAO组（n=29）和tMCAO组（n=23）。实验期间大鼠自由饮水、进食，室温保持（22±3）℃，相对湿度为（60±10）%，昼夜保持12 h交替变化。

1.2 脑缺血模型制备

1.2.1 大鼠pMCAO模型的建立：参照传统的LONGA法并加以改良[9]。①术前禁食，称体质量后10%水合氯醛（0.25 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉，颈部备皮、消毒；②颈部正中皮肤作一长约2 cm纵行切口，剪开浅筋膜、钝性分离颈部肌肉，暴露并分离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）以及与CCA伴行的迷走神经，于CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用；③显微动脉夹暂时夹闭ICA，CCA近心端及ECA结扎，于距CCA分叉部4～5 mm处剪一0.2 mm的“V”字型切口，将直径为0.26 mm的MCAO栓线经切口缓慢插入CCA；④将栓线沿着ICA缓缓送入MCA近端，以栓线上特制的黑色标记点刚好到达ICA与ECA分叉处，且进线遇阻力时停止进线，栓线插入深度从CCA分叉处开始计算约（18.0±1.5）mm，此时栓线头端恰位于MCA起始部；⑤结扎CCA远心端将栓线固定以防其滑脱，剪掉血管外多余栓线；⑥逐层缝合肌肉、腺体和皮肤，局部使用抗生素防感染。

1.2.2 大鼠tMCAO模型的建立：脑缺血2 h后，追加10%水合氯醛（0.1 mL/100 g）再次麻醉大鼠，拔出栓线。其余步骤同pMCAO模型操作。

1.2.3 CON组：颈部组织切开后，仅分离CCA、ICA和ECA，不插入栓线。其余步骤同pMCAO模型操作。

1.3 模型评价

1.3.1 神经行为学评分：参考LONGA等[9]确立的5级（0～4分）评分方法进行评分，分数越高，说明其神经行为缺损越严重。评分标准：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前肢；2分，行走时向对侧转圈；3分，站立不稳，向对侧倾倒；4分，不能独立行走，意识丧失。评分1～3分的SD大鼠纳入实验。CON组则均不出现以上任何类似症状。

1.3.2 磁共振成像评价：造模成功后24 h，使用 3.0 T（Philips Achieva）超导高场磁共振扫描仪及4通道大鼠专用线圈，行轴位T1WI、T2WI检查。扫描参数如下：快速自旋回波（turbo spin echo，TSE）序列T1WI：TE 20 ms，TR 2 000 ms，矩阵160× 160，FOV 40×40 mm，层厚1 mm，层间距0.12 mm，采集次数8次，扫描层数24，扫描时间4 min 32 s；T2WI：TE 80 ms，TR 3 198 ms，矩阵192×192，FOV 40×40 mm，层厚1 mm，层间距0.12 mm，采集次数8次，扫描层数24，扫描时间4 min 47 s。

1.4 脑组织的1H NMR检测 依据文献报道和前期工作方法进行NMR样品准备、1H NMR谱图采集、NMR数据预处理和模式识别、代谢物含量计算[10-11]。

1.4.1 NMR样品准备和1H NMR谱图采集：造模成功后7 d将大鼠断头、取脑，采用甲醇-氯仿-水提取法提取小分子代谢物制备NMR样品。使用Bruker AVANCE III 600 MHz NMR谱仪检测脑组织样本的1H NMR谱图，质子共振频率为600.13 MHz。探头温度控制为298 K，1H NMR采样谱宽9 615 Hz，采样点数64 K，累加64次。采得的时域信号充零至64 K后进行傅立叶变换，得到NMR谱。使用Topspin软件对所有的1H NMR谱图进行细致的相位校正和基线调整，将乳酸的甲基峰的化学位移定为1.33 ppm。

1.4.2 NMR数据预处理及代谢物含量计算：以δ0.01为区间将1H NMR谱图（δ10.000～-1.000）划分为1 100个等宽的区域，并对各个区域进行自动积分，且将δ5.150～4.690区域设为0积分段，消除压水峰时引起的谱线差异。归一化处理将数据输入SIMCA-P软件包进行PLS-DA分析，以第一和第二主成分（PC1和PC2）作为X、Y坐标轴构建二维空间（散点图，Scatterplot）。利用Chenomx NMR suite 6.0归属各类代谢物峰位置，再将各段积分相加且通过公式计算代谢物含量。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑缺血模型的建立及评价 所有实验大鼠术前均无行为学异常，Longa法评分均为0分。本实验中建立的pMCAO和tMCAO模型大鼠，右前肢均有不同程度的活动障碍。CON组大鼠均存活，pMCAO组大鼠存活率（24.1%，7/29）明显低于tMCAO组（47.8%，11/23）。

各组大鼠头颅MRI表现如图1所示。pMCAO组大鼠左侧大脑皮层及基底节区均可见T1WI低信号、T2WI高信号影，tMCAO组大鼠左侧基底节区及部分大脑皮层可见T1WI低信号、T2WI高信号影。CON组大鼠左侧大脑T1WI、T2WI未见异常信号。3组大鼠右侧小脑T1WI、T2WI均未见异常信号。

图1 大鼠头颅MRI表现

2.2 小脑1H NMR谱图及模式识别分析 大鼠小脑典型1H NMR谱图如图2所示，图2E列出了CON组小脑中能被1H NMR检测到的代谢物（N-乙酰基天冬氨酸：NAA；胆碱：Cho；乳酸：Lac；谷氨酸：Glu；谷氨酰胺：Gln；γ-氨基丁酸：GABA；丙氨酸：Ala；甘氨酸：Gly；天冬氨酸：Asp；肌酸：Cr；肌醇：m-Ins；琥珀酸：Suc；牛磺酸：Tau）。对各组大鼠小脑1H NMR谱图进行模式识别分析，得到相应样本的PLS-DA散点图（见图2B、2D、2F）。两两组间大鼠小脑代谢物在第一主成分上均能够明显区分，表明小脑代谢模式存在显著差异，说明大脑缺血可影响对侧小脑代谢，且脑缺血时长对小脑代谢变化存在影响。

2.3 小脑代谢物含量 从表1中可以看出，pMCAO组较CON组大鼠对侧小脑Ala、Lac含量显著下降，而GABA、Gln、m-Ins、Asp、Cre含量显著升高（P＜0.05）；tMCAO组较CON组大鼠对侧小脑Ala、Lac含量显著下降，而Glu、m-Ins、Asp、Cre含量显著升高 （P＜0.05）；tMCAO组较pMCAO组大鼠对侧小脑Gln含量显著下降（P＜0.05）。MCAO大鼠对侧小脑主要代谢通路变化情况如图3所示。

3 讨论

自BARON等[12]首次通过PET证实脑梗死患者对侧小脑氧和葡萄糖低代谢以来，“交叉性小脑神经机能联系不能”现象受到越来越多的关注，但既往多采用PET、SPECT、CTP、DSC-PWI等手段研究小脑变化[13-16]。本研究应用基于1H NMR的代谢组学技术对比研究tMCAO和pMCAO大鼠对侧小脑的代谢变化。

本研究中无论短暂性或永久性脑缺血，对侧小脑主要表现为Lac、Ala降低，而m-Ins、Asp、Cre升 高。Lac是糖酵解的终产物，Ala在酶的催化下可转变为丙酮酸从而参与糖酵解，是体内无氧酵解的标志物[17-18]。Lac、Ala降低，可能是因为脑缺血大鼠对侧小脑低血流量导致能量底物葡萄糖减少所致。小脑能量需求减低，无氧酵解途径亦减弱，这与既往研究[19]显示小脑葡萄糖代谢减低相一致。Cre是细胞内磷酸转运系统和能量缓冲系统的标志物，在ATP不足时参与机体供能。Cre升高表明小脑能量储备充足，这与小脑能量需求较低相适应。m-Ins是反映胶质细胞活性以及胶质渗透压调节的代谢 物[11，20]。m-Ins升高，表明小脑可能存在胶质细胞增生或细胞活性升高，胶质细胞渗透压调节的需求增强。兴奋性神经递质Asp升高，表明低代谢小脑的神经兴奋性代偿性增高。本研究中tMCAO组和pMCAO组大鼠对侧小脑NAA均正常，表明对侧小脑神经元无明显受损，与本研究MRI表现相一致。有学者对胶质母细胞瘤患者行MRS检查后发现，对侧小脑NAA显著下降[21]。这可能与不同病因脑损伤所致对侧小脑代谢改变不同有关。

图2 大鼠小脑1H NMR谱图（A、C、E）和PLS-DA图（B、D、F）

表1 小脑代谢物含量（mmol/kg）

Gln-Glu-GABA循环是神经胶质细胞和神经元间神经递质交换的主要途径，该循环中任何一个环节发生变化都可能影响到与之相关的代谢物含量[5，22]。 胶质细胞通过谷氨酸转运体吸收神经元释放的Glu，在谷氨酰胺合成酶的作用下转化成Gln，随后Gln被转运回神经元中并被谷氨酰胺酶水解成Glu，而GABA能神经元中的Glu可以在谷氨酸脱羧酶的作用下形成GABA。本研究结果显示，pMCAO组大鼠对侧小脑GABA和Gln升高，而tMCAO组大鼠对侧小脑Glu升高，表明短暂性和永久性脑缺血对小脑Gln-Glu-GABA循环代谢存在不同的影响。既往亦有研究表 明，急性期脑缺血可引起对侧小脑Gln-Glu-GABA循环紊乱[23]。胶质细胞中产生的Gln是神经元Glu和GABA合成的主要前体。本研究中tMCAO组较pMCAO组大鼠对侧小脑Gln下降，表明Gln可能对不同时长脑缺血所致对侧小脑代谢改变较灵敏。

图3 MCAO大鼠对侧小脑代谢通路变化

综上所述，短暂性和永久性脑缺血大鼠对侧小脑代谢均发生显著改变，主要涉及能量代谢（Lac、Ala）、神经递质代谢（Glu、Gln、Asp、GABA）和胶质细胞活性（m-Ins）。无论短暂性或永久性脑缺血，对侧小脑主要表现为能量代谢降低、神经兴奋性升高和胶质细胞活性增加。然而，不同时长脑缺血对小脑Gln-Glu-GABA循环代谢存在不同的影响。