HPLC-RID 测定发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量

赵鹏，杨明

江西济民可信集团有限公司，南昌 330096

发酵虫草菌粉（Cs-4）系从新鲜冬虫夏草中分离所得的虫草菌-蝙蝠蛾拟青霉（Cs-4）经深层发酵培养，将发酵产物过滤，干燥制成。发酵虫草菌粉（Cs-4）中含有腺苷、麦角甾醇、甘露醇、氨基酸等多种生物活性物质。其中，甘露醇在临床应用上是良好的利尿剂，具有降低颅内压、眼内压等功效。同时，甘露醇也可用作糖尿病患者用食品、健美食品等低热值、低糖的甜味剂。

目前，甘露醇的测定方法较多，常用的方法有高碘酸盐氧化法、旋光法、折光法、比重法、分光光度法、高效液相色谱法等［1-3］。其中高碘酸盐氧化法属于化学方法，适用较高纯度的甘露醇样品，对于复杂体系来说，检测会产生较大偏差。而旋光法属于物理方法，虽然方法较为简单，但更适合较高纯度的甘露醇样品。对于发酵虫草菌粉（Cs-4）复杂体系中甘露醇的检测，本文采用高效液相色谱-示差折光检测器法（HPLC-RID）［4,5］测定发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量，以期为发酵虫草菌粉（Cs-4）的全面质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪（岛津LC-20AD）、RID-20A 示差折光检测器（日本岛津公司）；电子天平（赛多利斯 BT25S）；恒温水浴锅（HH 系列XMTD-204）；超声波清洗仪（舒美 KQ-500E）。

1.2 试药甘露醇对照品（中国食品药品检定研究院；批号：100533- 201304；含量：99.0%）；乙腈为色谱纯；无水乙醇为分析纯。发酵虫草菌粉（Cs-4）（生产企业：江西国药有限责任公司；批号：18020076、18020077、18020078、18020081、18020083、18020098、18020109、18030140、18030146、18030175、18040181、18040182、18 040183；批准文号：国药准字Z10890021）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备取甘露醇对照品适量，精密称定，加流动相溶解制成每1 mL 约含2 mg 的对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备取供试品约1 g，精密称定，精密加入水25 mL，称定重量，50 ℃超声处理60 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，离心，取续滤液10 mL 至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用流动相溶解并定容至10 mL 量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件采用Carbomix Ca-NP 5∶8%色谱柱（7.8 mm × 300 mm，5 μm），以乙腈-水（10:90）为流动相；流速为0.5 mL/min；进样量为20 µL；柱温为80 ℃；示差折光检测器温度为55 ℃。在上述色谱条件，对照品及样品的色谱图见图1。

2.4 线性关系考察取甘露醇对照品适量，精密称取，加流动相溶解制成每1 mL 约含甘露醇4 mg 的对照品贮备液。精密量取对照品储备液0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL 分别用流动相稀释定容至10 mL量瓶中，得甘露醇质量浓度分别为0.099、0.198、0.989、1.978、3.955 mg/mL。分别精密吸取上述对照品溶液各20 μL，按“2.3”项下色谱条件进样测定峰面积，以对照品质量浓度X（mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算。可得甘露醇回归方程为：Y=3.233×105X+1.276×103（r=0.999 7）。结果表明，甘露醇质量浓度在0.099～3.955 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.5 稳定性试验取供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别于制备后0、2、4、8、16、24 h 进样，测定甘露醇的峰面积。结果，甘露醇的峰面积RSD为0.76%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6 精密度试验取供试品溶液，连续进样6 次，测定峰面积。结果，甘露醇的峰面积RSD 为0.62%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验取供试品（批号：18040182）1 g，按“2.2”项下的方法平行制备6 份供试品溶液，测定供试品中甘露醇的含量。结果，甘露醇含量的平均值为4.292%，RSD 为1.80%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密称取已知含量的样品（批号：18040182）约0.5 g，共6 份，精密称定，分别加入相当于供试品含量的对照品，按“2.2”项下的方法处理，按“2.3”项下色谱条件分析，记录色谱图，计算加样回收率，结果见表1。结果，甘露醇的平均回收率为96.0%，RSD 为1.67%。表明该方法回收率良好。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品测定取供试品13 批，按“2.2”项下的方法平行制备供试品溶液，每批次样品平行处理两份，每份进样两针，以平均面积计算甘露醇含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 %

（续表）

3 讨论

在方法研究过程中，本实验通过改变分析方法描述中的色谱条件参数，验证耐用性。通过对柱温条件进行筛选，于78 ℃、80 ℃、82 ℃柱温进行试验，分别计算甘露醇峰面积RSD%。RSD%分别为0.73%、0.57%、0.16%。结果显示，柱温变动符合系统适用性试验要求。通过对流速条件进行筛选，于0.4 min/mL、0.5 min/mL、0.6 min/mL 流速依据方法测定，分别计算甘露醇峰面积RSD。结果RSD分别为0.76%、1.40%、1.40%。表明，流速变动符合系统适用性试验要求。

《中国药典》2015 年版一部中收载的甘露醇含量测定方法均为滴定法，其测定的原理是氧化还原反应，但因发酵虫草菌粉（Cs-4）的发酵产物中含有还原性物质，测定时会干扰结果的准确性［6,7］。因此，本试验运用HPLC-RID 法测定发酵虫草菌粉（Cs-4）中甘露醇的含量，结果该方法操作简单，稳定可靠，准确性高。依建立的测定方法测定13批样品数据，结合以后工业化大生产可能出现的情况，因此暂定本品含甘露醇不得少于2.5%。

综上所述，所建立的方法可作为发酵虫草菌粉（Cs-4）的活性成分甘露醇的测定方法，为发酵虫草菌粉（Cs-4）的全面质量控制提供科学依据。