复方黄连油涂剂无菌检查方法适用性研究

鄢雷娜，王绎，陈希，刘卫德，储梅君，刘绪平*

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029；2.国科健康控股（江西）有限公司，南昌 330029

复方黄连油涂剂是由黄连、地榆、黄柏、黄岺、生大黄、虎杖、冰片和麻油香精组成，具有清热消肿，止痛解毒，排脓祛腐，消炎生肌等功效。用于Ⅰ-Ⅲ度烧烫伤，以及压疮、糖尿病足等局部皮肤溃疡的治疗。按照《中国药典》2015 版四部通则［1］涂剂项下规定，应对该品种进行无菌检查。该品种处方中麻油为油性基质，在样品前处理时，应对样品进行充分的乳化后再进行无菌检查。中药外用涂剂的无菌及微生物限度检查报道都相对偏少，大多数的报道还是停留在按照《中国药典》2005 年版和2010 年版建立的无菌和微生物方法的阶段。本文通过参考相关文献资料和《中国药典》2015 年版四部通则1101［1］，采用薄膜过滤法对复方黄连油涂剂进行无菌方法适用性试验，为该制剂的检验与研发提供有效可靠的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HTY-2000A 集菌仪（杭州高德泰林有限公司）；ACB-6A1 型垂直流超净工作台（新加坡ESCO 公司）；Heal Force900C 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；LDZX-40B 高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；PYX-DHS 型细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；KB400 霉菌培养箱（德国BINDER 公司）；EVS2 全封闭无菌检验过滤培养器（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 菌种

菌种均源自中国医学细菌保藏中心，试验所用菌株均为第2 代，具体信息详见表1。

表1 菌种信息表

（续表）

1.3 培养基及试剂

培养基及试剂均经过适用性试验验证，符合《中国药典》2015 年版［1］的要求。培养基具体信息见表2。

表2 培养基信息表

1.4 样品

复方黄连油涂剂（生产单位：江西本草天工科技有限责任公司；规格：每瓶100 mL）。

2 方法与结果

2.1 无菌检查方法学验证试验

2.1.1 菌液的制备根据《中国药典》2015 年版四部通则1101“无菌检查法”项下方法的规定［1］，制得每1 mL 含菌数分别不大于100 cfu 的大肠埃希菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽胞杆菌、黑曲霉菌悬液，并对所制备的菌液进行平板计数，结果见表3。

表3 菌液计数结果 CFU/mL

2.1.2 供试液制备按批出厂检验量取本品10 瓶，每瓶取20 mL，置灭菌盐水瓶中，加入42 ℃无菌十四烷酸异丙酯50 mL，振摇使其充分溶解，再加入0.1%无菌蛋白胨水溶液200 mL，充分振摇，静置，取下层水相作为供试液。

2.2 方法适用性试验

2.2.1 供试液的制备该试验中每支EVS2 型集菌培养器先用约0.1%无菌蛋白胨水溶液50 mL 湿润后，使0.1%无菌蛋白胨水溶液顺利流出，再将制备好的供试液全部抽入EVS2 型薄膜过滤器内过滤；然后用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每张滤膜的冲洗量为500 mL（100 mL/次），然后滤干并将硫乙醇酸盐液体培养基或胰酪大豆胨液体培养基滤入EVS2 型集菌培养器，加入少于100 cfu/mL 的试验菌（大肠埃希菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌：硫乙醇酸盐流体培养基；白色念珠菌、枯草芽胞杆菌、黑曲霉：胰酪大豆胨液体培养基），置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果。

2.2.2 阳性对照阳性对照组每支EVS2 型薄膜过滤器先用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液润湿，使0.1%无菌蛋白胨水溶液顺利流出，再用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每张滤膜的冲洗量为500 mL（100 mL/次），再分别加入各试验菌悬液1 mL，过滤。然后滤干并将硫乙醇酸盐液体培养基或胰酪大豆胨液体培养基滤入EVS2 型集菌培养器。

2.2.3 阴性对照阴性对照组中两支EVS2 型薄膜过滤器分别先用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液润湿，使0.1%无菌蛋白胨水溶液顺利流出，再用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每张滤膜的冲洗量为500 mL（100 mL/次），然后滤干并将硫乙醇酸盐液体培养基或胰酪大豆胨液体培养基滤入EVS2 型集菌培养器。

2.2.3 培养条件装有TSB 的集菌器置于23 ℃培养14 d，装有硫乙醇酸盐流体培养基的集菌器置于33 ℃培养14 d，逐日观察，记录阴性对照组、阳性对照组与试验组6 组试验菌株的生长情况。

2.3 验证试验结果

通过验证试验表明，本品采用薄膜过滤法过滤，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗（每张滤膜不少于500 mL，100 mL/次），6 组试验菌株阳性对照组与试验组生长同步无明显差异，阴性对照组无菌生长，说明该方法基本可行，结果见表4。

表4 方法验证试验

3 讨论

3.1 集菌培养器的选择

复方黄连油涂剂是油性制剂，在预实验时采用APY220 型集菌培养器，抽滤样品时出现压力过大或过滤速率过慢，长时间过滤不下去等现象，增加了染菌的风险，严重影响了结果判断的准确性［2,3］。后采用EVS2 型集菌培养器，上述问题均得到解决，最后试验确定选用EVS2 型集菌培养器。

3.2 供试液制备方法的考察

一些口服和外用中药制剂常含有较复杂的中药成分，这些成分均有不同程度的抑菌作用，所以在建立中药制剂无菌检查和微生物限度检查方法时需把消除样品的抑菌性考虑进去。本制剂含有黄连、地榆、黄柏、黄岺和生大黄等多种中药成分，地榆中的鞣质、生大黄中的蒽醌类和黄连中的异喹啉类生物碱均有不同程度的抑菌作用，采用薄膜过滤法，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，每张滤膜的冲洗量为500 mL（100 mL/次），可有效避免油脂类成分和一些中药抑菌成分吸附在过滤膜上［4-10］。

复方黄连油涂剂处方中麻油为油性基质，需对样品使用一定的乳化剂进行充分的乳化后再进行试验，本文采用了42 ℃无菌十四烷酸异丙酯使供试品充分溶解分散，并加入0.1%无菌蛋白胨水溶液200 mL 充分萃取，静置后取下层水相作为供试品溶液。本文考察了供试液的制备方法，根据《中国药典》2015 年版四部的取样标准，选择取本品10 瓶，每瓶20 mL，加入50 mL 十四烷酸异丙酯溶解，再以0.1%无菌蛋白胨水溶液200 mL 萃取，静置后分层效果较好，且方便操作［11,12］。

4 结论

该方法操作简单、结果准确、方法科学，为同类油性涂剂的无菌检查法提供了有效可靠的参考依据。