参苓白术散联合二甲双胍治疗对2型糖尿病肥胖患者miR-221、MCP-1、TNF-α的影响*

孙露阳,张欢妍,于雪冰,彭俊华,周红

(1.江苏大学医学院,江苏镇江212013;2.江苏大学附属金坛医院a.检验科，b.内分泌科，江苏常州213200)

中药及其提取物(如小檗碱)可通过降低单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6的分泌，缓解2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)的进程[1]。T2DM主要表现为葡萄糖(Glu)和糖化血红蛋白(GHb)升高，出现胰岛素耐受(insulin resistance, IR)，临床上多使用胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulin ratio，HOMA-IR)评价IR。近年来HOMA-IR的cut-off值在新发T2DM及T2DM前期的探讨亦较多[2]。

研究发现，miR-221与胰岛素受体信号通路IKK/PKC激活相关，在肥胖与T2DM进展过程中起重要的作用[3]。有学者在肥胖患者的脂肪间充间质干细胞中发现TNF-α水平升高可降低miR-221的表达[4]。中医认为肥胖者脾虚湿盛、致胰岛素耐受，参苓白术散有健脾、渗湿的作用，在脾虚湿困症T2DM患者中显示较好的疗效[5]。然而，目前尚不清楚参苓白术散是否可以通过调节miR-221表达而影响炎症因子水平，以缓解IR。本研究采用参苓白术散联合二甲双胍治疗肥胖型T2DM患者，并检测miR-221、炎症因子(MCP-1、TNF-α)及HOMA-IR、GHb的表达水平变化，以期为中西医联合治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2018年8月至2019年10月常州市金坛区人民医院内分泌科就诊的T2DM肥胖患者86例，男48例，女38例，年龄41～85岁，中位年龄26.5岁。均按照《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》明确诊断。纳入标准：体质指数(body mass index,BMI)≥25.0，空腹血糖≥7.0 mmol/L或随机血糖≥11.1 mmol/L，患者有糖尿病的临床症状。排除标准：除外心功能受损、肾功能及肝功能受损、肿瘤、结核、外伤或手术、急性感染性疾病者、自身免疫病、空腹血糖≤15.0 mmol/L或GHb≤11.0%、对二甲双胍及参苓白术散过敏者、治疗依从性差者。研究对象随机分为实验组和对照组，2组年龄、性别、BMI间差异无统计学意义(表1)。治疗方案：对照组为二甲双胍(国药准字号H20054786，常州制药厂公司)治疗，口服0.5 g/次、3次/d。实验组为参苓白术散(国药准字号Z11020755，北京同仁堂股份公司同仁堂制药厂)联合二甲双胍(同对照组)治疗，参苓白术散口服为6 g/次、3次/d。治疗持续6个月。本研究通过金坛区人民医院医学伦理学委员会批准(No. KY-2018-001)，入选对象均知情同意。

表1 各研究对象的临床资料

1.2仪器与试剂 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，AU5800生化分析仪和DX800I化学发光仪、640型紫外分光光度计(美国贝克曼库尔特公司)，D-10糖化血红蛋白分析仪和D-10糖化血红蛋白分析试剂包(美国Bio-Rad公司)，Uranus全自动酶免工作站(深圳爱康公司)。TaqMan miRNA提取试剂盒(中国香港Ambion公司)，miRNA cDNA第一链合成试剂盒(德国Qiagen公司)，血清TNF-α和MCP-1检测试剂盒(深圳欣博盛公司)，胰岛素、C肽和Glu测定试剂盒及配套质控品(美国贝克曼库尔特公司)。

1.3标本采集 于入组的实验对象治疗前、治疗1周、治疗3个月、治疗6个月时,分别采集空腹静脉血8 mL，其中1管用EDTA-K2抗凝管采集2.0 mL，另外2管用真空干燥管各采集3.0 mL，4 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-80 ℃保存。

1.4血清生化指标的检测 采用己糖激酶法，按照Glu测定试剂盒及AU5800生化分析仪说明书检测Glu；采用化学发光法，按照DX800I化学发光仪及其配套胰岛素测定试剂盒和C肽试剂盒说明书检测C肽的水平。采用高效液相色谱法(high efficiency liquid chromatography, HPLC)，按照D-10糖化血红蛋白分析仪及其配套糖化血红蛋白试剂说明书检测GHb的水平。所有检测项目均为室内质控合格。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5。采用ELISA法，按照Uranus全自动酶免工作站及其血清TNF-α和MCP-1检测试剂盒说明书检测TNF-α及MCP-1水平。Glu参考范围：4.1～5.9 mmol/L；HbA1c参考范围：3.6%～6.0%;C肽参考范围：1.1～4.4 μg/L；HOMA-IR参考范围：<2.65。

1.5RNA提取及逆转录 按照TaqMan miRNA提取试剂盒说明书提取上述静脉血标本总RNA，使用640型紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的样本。按miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，样本置-20 ℃保存。

1.6实时荧光定量PCR miR-221和内参U6的引物参照文献[6]，由上海生工公司设计并合成。miR-221上游引物序列：5′-ATCCAGTGCGTGTCGT-3′，下游引物序列：5′-TGCTAGCTACATTGTCTGCT-3′，退火温度60 ℃。U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，退火温度60 ℃。荧光定量PCR反应体系为20.0 μL，包括: 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 4.0 μL、10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL、RNase-free H2O 5.0 μL、cDNA 样本9.0 μL。采用 7500实时荧光定量PCR仪检测，循环参数: 95 ℃预变性15 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。使用StepOneTM软件采集荧光信号并进行熔解曲线分析，miR-221的相对表达水平以2-ΔΔCt法计算，公式: ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。每组设3个复孔，实验重复3次。

2 结果

2.1不同治疗方案及治疗时间对T2DM肥胖患者血清学指标的影响 实验组和对照组治疗前后血清GHb、HOMA-IR、C肽、Glu、miR-221、MCP-1和TNF-α水平差异均有统计学意义(P均<0.05)，进一步进行两两比较，发现GHb、HOMA-IR、MCP-1和TNF-α水平在相邻时相点间呈明显降低趋势，而C肽和miR-221在相邻时相点间呈明显升高趋势(P<0.05)。与对照组同时相点进行比较，治疗3个月后实验组的HOMA-IR、GHb、FG、MCP-1、TNF-α水平明显降低，但C肽和miR-221水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表1 不同治疗方案与治疗时间对T2DM肥胖患者血清学指标的影响(n=43)

2.2T2DM肥胖患者miR-221及HOMA-IR与其他血清学指标的相关性 经Pearson相关分析， T2DM肥胖患者血清miR-221水平与MCP-1(r=-0.795,P=0.000)、TNF-α(r=-0.612,P=0.000)、HOMA-IR(r=-0.684,P=0.000)、Glu(r=-0.485,P=0.000)、GHb(r=-0.591,P=0.000)呈负相关，与C肽(r=0.653,P=0.000)呈正相关。T2DM肥胖患者HOMA-IR与MCP-1(r=0.728,P=0.000)、TNF-α(r=0.621,P=0.000)、 Glu(r=0.478,P=0.000)、GHb(r=0.584,P=0.000)呈正相关，与C肽(r=-0.622,P=0.000)呈负相关。

3 讨论

二甲双胍是2型糖尿病肾病防治指南[7]中推荐治疗糖尿病的首选药物。该药物具有良好的降低血糖、降低血脂、减轻体重、调节肠道菌群、降低MCP-1及TNF-α表达、减少炎症反应等作用[8-9]。本研究结果表明，对照组T2DM肥胖患者治疗后的MCP-1、TNF-α、HOMA-IR、GHb、Glu水平明显降低，并呈现时间效应，证实二甲双胍能抑制炎症因子MCP-1、TNF-α的表达水平、降低Glu和GHb水平，缓解T2DM患者发生IR[9-10]。

中医认为脾虚湿困、代谢紊乱是糖尿病发生的主要原因，通过健脾、益气和提高机体免疫功能可治疗疾病。本研究结果发现，与对照组比较，实验组于治疗3个月后患者血清HOMA-IR、GHb、Glu、MCP-1、TNF-α水平明显降低，进一步的相关性分析发现T2DM肥胖患者的HOMA-IR与血清MCP-1、TNF-α、GHb、Glu水平间呈正相关，以上结果表明，实验组(联合用药组)在降低Glu、IR及炎症因子水平方面较对照组(单纯二甲双胍组)的效果更佳，考虑参苓白术散通过降低炎症水平、减轻炎症反应，可以缓解IR和高血糖，证实参苓白术散具有降低炎症因子(如IL-6、TNF-α、MCP-1等)水平和治疗脾虚湿困症的作用[5]。以上研究表明，参苓白术散通过降低炎症因子的表达，降低Glu和GHb，缓解IR，可以用于治疗糖尿病。

微小RNA(miRNA)是一类具有广泛生物活性的非编码小分子RNA，在细胞内外进行物质传递和信号通路分子的调节[11-12]。研究表明，miR-221参与机体的炎症反应、IR及胰岛素IKK/PKC信号途径，且肥胖患者血清中miR-221的表达与TNF-α水平呈负相关[4]。本研究发现，与对照组同时相点比较，实验组治疗3个月后miR-221水平明显升高，且T2DM肥胖患者miR-221与HOMA-IR、MCP-1、TNF-α、GHb和Glu水平呈负相关。以上结果表明，提高miR-221水平可缓解T2DM患者的IR，降低Glu和GHb，分析原因，可能实验组miR-221表达水平升高，降低炎症因子水平，从而缓解T2DM患者发生IR，并且降低血糖。但是，miR-221与炎症因子、HOMA-IR之间的相关性仍需要进一步研究证实。中药治疗糖尿病机理的一个新关注点是“菌群-黏膜免疫-炎症-糖尿病”轴[13]，中药在体内是通过多靶点、多作用机理治疗疾病，本研究从“miR-221-炎症因子-胰岛素耐受”方面阐述苓白术散联合二甲双胍治疗糖尿病的机理，为中西药联合治疗T2DM提供依据，为中药多靶点治疗疾病机理研究提供参考。

本研究基于医院患者进行研究，尚存在一些不足之处，如患者选择的偏倚、实验条件管控的不一致、研究的病例数不够多、观察时间是否足够长等。此外，对照组设置不完善，尚缺乏单一中药组。未来，我们将进一步通过选用动物模型、严控实验条件等，提高实验结果的准确性和可靠性，必要时采用体外细胞实验验证各指标间的相关性。

综上所述，参苓白术散联合二甲双胍治疗T2DM肥胖患者，治疗效果优于单用二甲双胍，表现为治疗后HOMA-IR和GHb降低，分析原因可能与增加miR-221表达、降低炎症因子(MCP-1和TNF-α)水平有关，但还需要大样本病例以及动物实验进一步验证。