染色体微阵列分析联合核型分析在胎儿轻度脑室增宽中的应用

李景然，王朝红，黄道奇，涂华玉，童克婷，叶登美，刘慧芳，朱健生

(安徽医科大学附属安徽省妇幼保健院遗传医学中心，合肥230000)

脑室增宽(ventriculomegaly，VM)是产前超声检查常见的胎儿畸形，与许多神经疾病有关，如自闭症、癫痫和不明原因的神经发育迟缓等[1]。在妊娠15～40周时，侧脑室的直径保持相对稳定，平均为5.4～7.6 mm,正常上限为10 mm，当单侧或双侧脑室直径在10～15 mm之间为轻度VM，直径>15 mm为重度VM[2]。VM形成与染色体异常有关，当染色体异常时，可引起中脑胶质增生、导水管狭窄及隔膜形成，从而导致VM[3]。核型分析是染色体异常筛查的金标准，可以显示微小标记染色体(sSMC)数目和形态，但分辨率较低、周期长，且不能确定其来源[4]。染色体微阵列分析技术(CMA)具有高分辨率和全基因组的特点，可识别染色体数目异常和常规核型分析无法检测出的微缺失和微重复，然而，CMA也有自身的局限性，如不能检出倒位和平衡易位等。因此，本研究拟将CMA及核型分析相结合，有助于发现胎儿染色体核型和染色体亚显微结构的异常，从而为产前咨询医生提供胎儿预后评估的依据。

1 资料和方法

1.1研究对象 选择2017年2月至2019年12月于我院超声科行产前超声检查诊断为轻度VM的55例孕妇作为研究对象，年龄(29.96±5.20)岁，孕19～26周。纳入标准[2]：单胎，产前超声检查发现胎儿VM符合轻度VM诊断标准，伴或不伴其他超声表现异常者。排除标准：多胎妊娠，胎儿脑积水，TORCH血清学检查阳性，孕妇感染急性期，未进行随访的患者。本研究经安徽省妇幼保健院医学伦理委员会批准[批准文号：2016(09)]，患者或家属知情同意。

1.2试剂与仪器 吉姆萨染液(珠海贝索公司)，羊水培养基(美国Gibco公司)，原位载玻片培养盒(杭州博圣公司)，QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen 公司)。Nanodrop 2000分光光度计、AffymetricCytoScan 750K Array分析平台(美国Thermo Fisher Scientific公司)，CDS-5染色体分散仪(美国Thermotron公司)，GSL-120自动扫描仪和图像分析系统(德国Leica公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集及核型分析 孕妇于妊娠18～26周，由产前诊断中心抽取羊水24 mL，分为2管，258×g离心10 min，弃上清液，留取0.5 mL细胞悬液于原位载玻片培养盒中，加入羊水培养基3 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养7～8 d，加入秋水仙素80 μL(20 μg/mL)置培养箱25 min，低渗(加入1%柠檬酸钠5 mL)室温静置25 min，预固定(5%冰乙酸固定7 min)，固定(甲醇∶冰乙酸=3∶1，固定10 min)，取出载玻片，用纱布吸取多余固定液，置入分散仪中，待玻片完全干燥，取出玻片，置于80 ℃烤箱烤片2 h，1.5 g/L胰蛋白酶消化14～18 s，吉姆萨染色12～15 min，晾干后上机，采用GSL-120自动扫描仪捕获羊水核型。使用Leica cytovision核型分析软件计数20个中期细胞核型，并分析5个核型，如有异常核型，增加计数量。

1.3.2样本DNA提取 取孕妇羊水10 mL置于离心管中，580×g离心10 min，弃上清液。按照QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书提取基因组DNA，Nanodrop 2000分光光度计检测DNA浓度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的样本，置-20 ℃保存。

1.3.3CMA检测 采用AffymetricCytoScan 750K Array分析平台对羊水细胞DNA进行检测，分析平台主要设备包括AutoloaderDx2自动加载仪、GCS3000DX2芯片扫描仪、GCS3000Dx2 Workstation 工作站、FS450DX2 洗涤工作站、GCS3000Dx2 Workstation 工作站、Affymetrix®Chromosome、Analysis Suite(ChAS)2.0 分析软件等。按照厂家标准操作。所得结果与国际基因组变异数据库 the Database of Genomic Variants(http：//projects. ca/variation/cgi-bin/gbrowse/GRCh37)对比剔除常见的多态性拷贝数变异(CNVs)，其余CNVs与病理性CNVs数据库(the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，http：//www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)比较，基因相关的临床信息经在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，www.ncbi. nlm.nih.gov/Omim/getmorbid.cgi)进行鉴定。最后使用PubMed数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)检索相似或相同区段的 CNVs 相关文献，综合所得数据库报道信息，判读 CNVs 的临床意义，按照美国医学遗传学与基因组学会指南[5]，将CNVs分为3大类5级：(1)致病性CNVs(pCNVs)；(2)良性CNVs；(3)临床意义未明的CNVs(VOUS)；(4)可能致病性CNVs；(5)可能良性CNVs。

1.4统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行。计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.155例VM中核型分析检出的异常结果 55例轻度VM中核型分析检出3例异常核型(分别为2例21-三体和1例4p缺失)，检出率为5.5%(3/55)。

2.255例VM中CMA检出的异常结果 经CMA验证，55例轻度VM中共检出5例VOUS，检出率9.1%(5/55)。进一步对病例1、2、3、5进行来源验证，其中病例1、3、5来源于母亲，病例2来源于父亲。病例4未进行来源验证，经随访，婴儿无明显表型异常。病例6为Y染色体存在3.75 Mb重复，该重复为可能良性CNVs，经CMA验证该重复来源于父亲。病例7为15号染色体存在1.74 Mb重复，该重复为可能致病性CNVs，经CMA验证该重复来源于母亲。55例轻度VM中共检出4例pCNVs，检出率为7.3%。其中病例8为16号染色体存在1.7 Mb缺失，病例9为4号染色体存在26.19 Mb缺失，病例10、11为21-三体综合征，以上4例pCNVs均可引起智力低下，发育迟缓等表型。见表1。

表1 10例脑室增宽胎儿染色体异常分析及妊娠结局

2.3核型分析与CMA检测以及联合检测的检出率比较 单独使用核型分析的异常核型检出率为5.5%(3/55)，单独使用CMA对致病性CNVs的检出率为7.3%(4/55)，两者联合对致病性CNVs的检出率为7.3%(4/55)，与单项CMA及核型分析相比，差异无统计学意义(χ2分别为0.153、0.011，P>0.05)。

3 讨论

由于不同类型的VM病因和预后不同，对胎儿VM的遗传咨询和产前诊断也不同。尤其是轻度至中度VM的胎儿预后变化很大，给产前咨询医生带来一定困惑。因此，母婴医学会推荐：轻到中度VM胎儿进行羊水染色体核型和染色体微阵列分析[6]。

随着医学的发展，CMA在神经发育障碍患者中得到广泛的应用。美国妇产科医生指南(ACOG)指出，当超声检出胎儿的1个或多个主要结构异常时，建议将CMA作为常规染色体核型分析的替代方法。Duan等[7]研究表明，CMA在核型正常的VM中可检出6%的异常，是目前有效的产前诊断方法。而本研究中55例VM经CMA检测共检出5例VOUS，检出率为9.1%(5/55)。5例VOUS中，对1、2、3、5病例进行来源验证，并找到了相应的来源。病例4未进行来源验证，经随访婴儿无明显表型异常。病例6为Y染色体存在3.75 Mb重复，该重复为可能良性CNVs，经CMA验证，该重复来源于父亲。病例7为15号染色体存在1.74 Mb重复，该重复为可能致病性CNVs，经CMA验证，该重复来源于母亲。虽然这些病例进行了来源验证，但就目前对人类基因组的认识和数据库的积累，仍无法对全部结果给出确切的临床性质判读，也给临床医师的诊断带来新的挑战，这也是该技术的局限性。所以，要做好检测前后的咨询工作，对VOUS、可能良性CNVs、可能致病性CNVs仍要进行跟踪性随访[8]。相信随着CMA的应用和数据库数据的不断更新及改进，未来这些异常结果的发生率会逐渐降低。

本研究结果表明，55例VM中检出4例pCNVs，检出率为7.3%，与宓娴贤等[9]报道的5.46%结果相近；与彭奕贤等[10]报道的26.6%存在一定差异，这种差异的原因不排除样本不足引起的结果偏倚或与VM合并其他超声畸形有关。由此可见，除染色体核型异常外，pCNVs也是VM胎儿较常见的染色体异常[8]。本研究4例pCNVs均可导致胎儿智力低下、发育迟缓，这也可能是引起VM的原因。4例pCNVs中，2例为21-三体，由此可见VM是该综合征常见的软指标[11]。本研究中，单独使用核型分析检测出3例异常核型，检出率为5.5%；单独使用CMA检测出4例异常核型，检出率为7.3%；联合检测的异常核型检出率为7.3%，单独与联合检测结果经卡方检验比较，差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测虽未增加异常核型的检出率，但两者联合可进一步了解染色体核型异常。如核型分析可检出平衡易位、倒位和小标记染色体等；CMA可检出单亲二体、非平衡易位和<5 Mb的 pCNVs等，因此，两者联合可弥补各自的不足。

综上所述，轻度VM胎儿进行核型分析和CMA检测，有助于发现胎儿染色体核型和染色体亚显微结构的异常。两者相结合，使异常结果得到验证，2种检测方法又互为补充，从而为产前咨询提供更详细和更全面的胎儿预后的依据。本研究样本量不足，实验结果可能存在一定的偏倚，还需要进一步扩大样本量来验证。