基于灰色关联分析的藤茶不同极性部位在小鼠体内抗炎作用的谱-效关系研究

刘雯 刘云 刘进宝 郭海姣 郑丽贞 周丽园 钟燕妮 覃洁萍

摘 要 目的：研究藤茶不同極性部位的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱与其体内抗炎作用的谱-效关系。方法：取藤茶药材，以70%乙醇回流提取，再分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，或直接以水煎煮，浓缩后获得藤茶不同极性部位。建立二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型，以地塞米松为阳性对照，分别考察藤茶不同极性部位的抗炎活性。采用HPLC法建立藤茶不同极性部位的指纹图谱，色谱柱为Poroshell 120 EC-C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为365 nm，进样量为5 μL。运用灰色关联度法分析藤茶不同极性部位HPLC指纹图谱共有峰与其抗炎药效之间的谱-效关系，计算关联系数、关联度并进行排序。结果：小鼠抗炎实验结果显示，藤茶70%乙醇提取总部位、乙酸乙酯萃取部位、水提取部位的抗炎活性最明显（小鼠耳肿胀抑制率分别为54.07%、30.54%、30.45%）。藤茶不同极性部位HPLC指纹图谱中共确定了5个共有峰。谱-效关系分析结果显示，5个共有峰的关联度均大于0.6;其中，抗炎效果较强的是3号峰和2号峰（二氢杨梅素），两者的关联度均大于0.8。结论：藤茶对二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用是多组分协同作用的结果;3号峰未知成分和二氢杨梅素可能是藤茶抗炎作用的主要活性成分。

关键词 藤茶;指纹图谱;抗炎活性;谱-效关系;灰色关联分析

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the spectrum-effect relationship of HPLC fingerprint of different polar parts of Ampelopsis grossedentata with its in vivo anti-inflammatory effect. METHODS： A. grossedentata was reflux extracted with 70% ethanol， then extracted with petroleum ether， chloroform， ethyl acetate and water saturated n-butanol; or it was directly decocted with water and then concentrated to obtain different polar parts. The xylene-induced mice ear swelling model was established; using dexamethasone as positive control， anti-inflammatory activity of different polar parts of A. grossedentata was investigated. Fingerprints of different polar parts of A. grossedentata were established by HPLC. The determination was performed on Poroshell 120 EC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was 25 ℃. The detection wavelength was set at 365 nm， and sample size was 5 μL. The grey ralational analysis method was used to analyze the spectrum-effect relationship of HPLC fingerprint common peaks of different polar parts of A. grossedentata with its anti-inflammatory effect. The correlation coefficient and correlation degree were calculated and ranked. RESULTS： Anti-inflammatory experiment showed that the anti-inflammatory effects of 70% ethanol extraction part，ethyl acetate extraction part and water extraction part were the most significant （inhibitory rates of ear swelling were 54.07%， 30.54%， 30.45%）. Five common peaks were determined in HPLC fingerprints of different polar parts from A. grossedentata. The spectrum-effect analysis results showed that the correlation of 5 common peaks were higher than 0.6; among them， peak 3 and peak 2 （dihydromyricetin） had the strongest anti- inflammatory effect， and their correlation degrees were both greater than 0.8. CONCLUSIONS： The anti-inflammatory effect of A. grossedentata on xylene-induced ear swelling in mice is the result of multi-component synergy; unknown substance of peak 3 and dihydromyricetin may be the main active components of A. grossedentata.

2.3 藤茶不同极性部位的HPLC指纹图谱建立

2.3.1 溶液制备 （1）混合对照品溶液：精密称取杨梅素、二氢杨梅素对照品各适量，置于同一量瓶中，加入甲醇溶解制成每1 mL含杨梅素56.7 μg、二氢杨梅素103.2 μg的混合对照品溶液。（2）藤茶不同极性部位供试品溶液：分别称取藤茶Ⅰ～Ⅵ部位样品各适量，置于不同量瓶中，加入甲醇溶解制成質量浓度分别为3.00、3.37、6.02、3.05、9.10、3.02 mg/mL（以干膏量计）的供试品溶液。

2.3.2 色谱条件 色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，4.0 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，10%A→15%A;20～40 min，15%A→19%A;40～66 min，19%A→32%A;66～67 min，32%A→10%A）;流速：1 mL/min;柱温：25 ℃;检测波长：365 nm;进样量：5 μL。

2.3.3 方法学考察 （1）精密度试验：取“2.3.1（2）”项下的Ⅰ部位供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件连续进样分析6次，记录各色谱峰保留时间和峰面积。结果，各色谱峰保留时间和峰面积的RSD均小于1%，表明方法精密度良好。（2）重复性试验：取“2.1.2”项下的Ⅰ部位萃取物样品共6份，精密称定，按“2.3.1（2）”项下方法配制供试品溶液，再按“2.3.2”项下色谱条件进样分析，记录各色谱峰保留时间和峰面积。结果，各色谱峰保留时间和峰面积RSD均小于3%，表明方法重复性良好。（3）稳定性试验：取“2.3.1（2）”项下的Ⅰ部位供试品溶液，于室温条件下放置0、2、4、8、12、24 h后再按“2.3.2”项下色谱条件进样分析，记录各色谱峰保留时间和峰面积。结果，各色谱峰保留时间和色谱峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在室温条件下放置24 h较稳定。

2.3.4 指纹图谱的建立 取“2.3.1”项下的混合对照品溶液和Ⅰ～Ⅵ部位供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件进样分析，采集色谱图。将色谱图“cdf”格式文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》中，生成指纹图谱。结果，共确定了5个共有峰，详见图1（图中，R表示共有模式，S1～S2分别表示Ⅰ～Ⅵ部位供试品溶液）。

2.3.5 HPLC指纹图谱特征峰的标定 取“2.3.1（1）”项下混合对照品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件进样分析并采集色谱图，然后与“2.3.4”项下得到的色谱图共有峰进行比对。结果显示，2号峰为双氢杨梅素，5号峰为杨梅素。混合对照品溶液和藤茶极性部位供试品溶液的高效液相色谱图见图2（其中，供试品溶液以Ⅰ部位供试品溶液为代表进行峰位比对，其余部位供试品样品图略）。

2.4 藤茶不同极性部位HPLC指纹图谱与抗炎活性的灰色关联度分析

2.4.1 数据集建立 以藤茶6个不同极性部位（Ⅰ～Ⅵ）样品的HPLC指纹图谱中5个共有峰峰面积（即按称样量和出膏得率折算成相等生药量后对应的峰面积）和上述样品对小鼠耳肿胀的抑制率建立数据集，结果见表2。

2.4.2 数据无量纲化处理 由于表2数据中峰面积和肿胀抑制率的量纲不一致，因此采用均值化法对数据进行无量纲化处理：K′i（j）=Ki（j）/Ki（j），K′i（t）=Ki（t）/Ki（t）。式中，K′i（j）为原始数据均值化处理后的数据，Ki（j）为原始数据，Ki（j）为第i批样品第j个指标的均值化处理后的数据，t为参考序列[11，13]，结果见表3。

2.4.3 关联系数的计算 以藤茶不同极性部位（Ⅰ～Ⅵ）对小鼠耳肿胀的抑制率为参考序列（t），以峰面积为比较序列（j），求参考序列与比较序列的灰色关联系数：ξi（j）=（minΔKi（j）′+ρ×maxΔKi（j）′）/（|Ki（j）′-Ki（t）′|+ρ×maxΔKi（j）′），式中，分辨系数ρ取值为0.5[11，13]，结果见表4。

2.4.4 关联度和关联序的计算 分别计算各参考序列与比较序列之间的灰色关联系数的均值，即关联度，并对其进行排序，组成关联序，结果见表5。由表5可见，5个共有峰峰面积与小鼠耳肿胀抑制率的关联度均大于0.6，说明藤茶抗炎作用是多组分协同作用的结果[9]。根据关联序结果可知，抗炎效果较强的是3号峰和2号峰，两者关联度均大于0.8。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本研究考察了多种十八烷基硅烷键合相色谱柱，发现Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，4.0     μm）的分离效果明显优于其他5.0 μm粒径的色谱柱;采用乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，获得的色谱图基线平稳，色谱峰峰形状佳、分离度好。

3.2 藤茶不同极性部位的谱-效关系分析

藤茶功效清热解毒、消炎利咽，民间主要用于治疗咽喉炎、皮肤病、感冒发烧等症，因此本研究选择抗炎活性作为藤茶药效学指标对其药效进行评价;中药指纹图谱作为一种综合的可量化的检测手段，可以反映中药中化学成分的构成和含量，故本研究选择HPLC指纹图谱作为检测藤茶中化学成分的手段。灰色关联法是根据因素之间发展趋势的相似或相异程度，作为衡量因素间关联程度的一种方法，该方法对样本数量和数据规律性的要求较低，适用于评价中药化学成分与药效之间的关联程度，筛选功效成分[11，13]。本研究采用灰色关联分析对藤茶不同极性部位的谱-效关系进行考察，旨在筛选出藤茶中的抗炎活性物质。结果显示，藤茶不同极性部位的HPLC指纹图谱中共确定了5个共有峰;二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验结果显示，70%乙醇提取总部位、乙酸乙酯萃取部位、水提取部位的抗炎作用显著;进一步通过灰色关联度法分析后发现，5个共有峰对藤茶抗炎效果的贡献均较大（关联度均大于0.6），其中抗炎效果较强的是3号峰（未知成分）和2号峰（二氢杨梅素）。

综上所述，藤茶对二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用是多组分协同作用的结果;HPLC指纹图谱中的3号峰未知成分和二氢杨梅素是藤茶抗炎作用的主要活性成分。其中，3号峰对应的未知成分尚需進一步进行结构分析。

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（收稿日期：2020-04-03 修回日期：2020-08-05）

（编辑：段思怡）