DOE实验方法在亲和层析中的应用

佘伊莎，张甘良

（1.复旦大学，上海 200433；2.上海津曼特生物科技有限公司，上海201210）

随着生物技术的发展，单克隆抗体的制备技术也越来越成熟。作为一种治疗型生物药品，单克隆抗体在医药市场上逐渐发挥出重要的作用，尤其在肿瘤及免疫系统疾病方面。抗体的纯化是抗体生产过程中重要的一部分，一般分为3步纯化[1]，即亲和层析加两步离子交换层析，或亲和层析加疏水层析及离子交换层析。

亲和层析是单抗纯化三步法中的第一步，是重要的纯化步骤，主要起到捕获蛋白的作用，即将抗体从细胞培养收获液中富集出来。经过一步亲和层析，细胞培养收获液中的大部分杂质都会从层析柱中流穿出去，抗体则会结合到层析填料上，在洗脱条件下抗体与填料分离，收集洗脱液，则可得到纯度较高的抗体，再经过之后的精纯步骤进一步提高样品纯度。

DOE（Design of Experiment，即实验设计）是一个工具，一种实验方法，一种基于统计学原理的设计实验的技术[2]，可以用最少的实验确定关键性因素及其相互作用[3]。DOE的实验方法在生物医药产业中逐渐得到推广，在原核细胞表达[4]、细胞因子[5]及抗体[6]等产品中使用该方法，通过对工艺更加全面的考察，达到降低工艺成本[7]、进行工艺优化[8]等目的。本研究使用DOE方法摸索亲和层析的工艺条件，以最少的实验筛选出亲和层析的关键工艺参数，并初步确定工艺参数范围。

1 材料与方法

1.1 样品

上样样品由上海津曼特生物科技有限公司经细胞株开发后进行生物反应器培养，经过一定培养天数后进行收获，收获液经深层过滤，得到澄清液，即为亲和层析使用样品。

1.2 仪器和试剂

AKTAAVANT150层析系统，美国GE公司；Vantage25层析柱，直径1.1 cm，高25 cm，美国默克公司；MabSelectSure层析填料，美国GE公司。Tris，药用级，美国ANGUS公司；稀盐酸，药用级，湖南尔康制药股份有限公司；氯化钠，药用级，江苏勤奋药业有限公司；冰醋酸，药用级，南京化学试剂；醋酸钠，药用级，南京化学试剂；1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

亲和层析采用结合-洗脱模式进行，澄清液中性条件上样，低pH条件洗脱，收集洗脱液送检测定质量。平衡液为50 mmol/L Tris-HCl+0.15 mmol/L NaCl，pH 7.2，洗脱液为 50 mmol/L HAc-NaAc。如表1所示，采用三因素两水平全因子分析DOE模型进行实验，输入因子为柱高、载量、洗脱pH，输出响应值为回收率及洗脱液SEC（Size Exclusion Chromatography，分子排阻色谱法）单体纯度。

表1 DOE实验条件

1.4 样品分析

使用高效液相色谱法，用分子筛色谱分析检测亲和洗脱收集液的单体纯度。

1.5 数据处理

使用层析系统控制软件自带的数据处理功能模块，将检测数据逐一输入对应的实验条件下，生成箱线图及响应曲面图以进行系统分析。

2 结果与分析

2.1 DOE实验结果

DOE实验的回收率及检测的SEC-HPLC单体纯度如表2所示。亲和层析的目的是将抗体从细胞培养收获澄清液中捕获出来。由于澄清液一般成分较复杂，混有HCP（HostCellProtein，宿主细胞蛋白）、色素、培养基成分等，且上样样品体积较大，因此对于收率的要求为＞90%，SEC-HPLC单体纯度的要求为＞95%。从表2的实验结果可以看出，在柱高15～25 cm，载量 19～37 mg/mL 填料，洗脱 pH 3.2～4.0的范围内，SEC-HPLC纯度无显著差异，均在95%以上，满足亲和层析的要求。在洗脱pH为4.0的条件下，收率低于目标值90%。

表2 DOE实验结果

2.2 输入因子与输出变量箱线图分析

图1为输入因子与输出变量箱线图，对于回收率，洗脱pH具有显著性影响，柱高、载量及洗脱pH之间没有明显的交互作用；对于SEC-HPLC单体纯度，洗脱pH对其具有较大的影响，而柱高和载量对其的影响则较小。同时，柱高、载量及洗脱pH 3个因子之间的交互作用对SEC的纯度影响也较小。

图1 输入因子与输出变量箱线图

2.2 回收率和SEC纯度响应曲面分析

从图2中可以看出，对于回收率，以洗脱pH为X轴，与多条收率的等高线相交，验证了洗脱pH能显著影响亲和层析收率。若要满足收率大于90%的要求，则洗脱pH应控制在3.2～3.6。根据回收率等高线的趋势，可以看出洗脱pH的值越低，载量越高，回收率就越高。

从图3的SEC-HPLC的响应曲面图来看，洗脱pH为X轴，也与多条纯度等高线相交，也同样验证了箱线图的结论。对于SEC纯度，pH越高，载量越高，纯度也越高。综合考虑，3.2～3.6的洗脱pH范围既能满足收率＞90%，也能满足SEC单体纯度＞95%的要求，在不超载的情况下尽量使用高载量进行实验，层析结果较好。

图2 回收率响应曲面图

图3 SEC纯度响应曲面图

3 结论

洗脱pH为亲和层析工艺中最重要的参数，初步确定了满足工艺需求的操作值范围为pH 3.2～3.6；柱高、载量及洗脱pH 3个参数间的交互作用对层析结果影响较小；洗脱pH和载量越高，产品SEC纯度越高；pH越低、载量越高，则回收率越高。