拉曼光谱法鉴别分析3种甾体类避孕药晶型*

周健，杨世颖，张丽，张宝喜，吕扬

(中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

口服避孕药占现代避孕方式的14%。至2019年全世界有超过1亿妇女在服用口服避孕药。目前绝大多数口服避孕药化学结构为甾体类激素[1]。甾体类避孕药物通常可以分为3类：①黄体酮类衍生物，如甲地孕酮、甲孕酮等；②雌激素类衍生物，如炔雌醇、炔雌醇环戊醚等；③睾酮类衍生物，如炔诺酮等。甾体类避孕药通常存在多晶型现象，不同晶型会影响药物溶解性、稳定性等理化性质，进而对生物利用度产生重要影响，不同药物晶型在机体内的吸收差异可至数倍乃至数十倍[2-4]。因此对甾体类避孕药进行多晶型研究，对于提高其质量控制水平和更好发挥治疗效果至关重要。

拉曼光谱是一种基于拉曼散射原理、由分子极化率变化产生、进而反映化合物分子结构中基团振动信息的分子振动光谱[5-6]。拉曼光谱由于具有快速、无损、检测样品无需复杂前处理，并且可以和红外光谱形成有力互补等优点，已成为药物多晶型研究的重要技术[7]。利用拉曼光谱进行多晶型鉴别时，100 cm-1以下光谱低频波段常具有一些非常有意义的特征光谱。同时药物多晶型拉曼光谱特异性较强，大量实验观察发现，对拉曼光谱差异细微的药物多晶型进行定性鉴别时，2～3 cm-1波数变化即可用来判定晶型间差异。笔者利用拉曼光谱技术对3种甾体类避孕药物(米非司酮、炔雌醇、左炔诺孕酮)的多晶型开展鉴别分析研究，为利用拉曼光谱技术对甾体类避孕药物的多晶型开展鉴别分析，提高该类药物的质量控制水平，提供了科学依据和数据支持。

1 仪器与试药

1.1仪器 D/max 2550粉末X射线衍射仪(日本Rigaku公司)；Horiba HR evolution高分辨拉曼光谱仪(法国HORIBA公司)。

1.2试药 米非司酮原料(华润紫竹药业有限公司，含量：100.3%，批号：20190104)；炔雌醇原料(华润紫竹药业有限公司，含量：100.9%，批号：20190104)；左炔诺孕酮原料(武汉远成共创科技有限公司，含量：98.0%，批号：20170329)。

2 方法与结果

2.13种甾体类避孕药物多晶型的晶型确证 本实验采用的3种甾体类避孕药物多晶型物质均来源于本实验室前期制备样品，采用粉末X射线衍射法(powder x-ray diffraction，PXRD)进行表征，并与文献报道的每种晶型标准图谱进行比对[8-14]，以确证研究对象晶型种类及是否发生转晶。PXRD分析条件：CuKα辐射，石墨单色器，管压40 kV，管流150 mA，2θ扫描范围3 °～80°，扫描速度8 °·min-1，步长0.02 °，发散狭缝DS=1 °，接收狭缝RS=0.15 mm，防散射狭缝SS=1 °。米非司酮、炔雌醇、左炔诺孕酮不同晶型PXRD图谱见图1。实验结果表明，3种甾体类避孕药物多晶型样品均为晶型纯品，可用于开展拉曼分析研究。

2.23种甾体类避孕药物多晶型拉曼光谱表征 每种样品取5 mg，用于拉曼光谱测试。光谱采集范围：200～4000 cm-1；激光波长：633 nm；光栅刻线密度：600 gr·mm-1；采集时间：3 s；累计次数：3次。为确保拉曼光谱一致性和稳定性，对同一种晶型样品平行采集光谱3次。结果表明本研究中3种甾体类避孕药物多晶型拉曼光谱具有良好可重复性。米非司酮、炔雌醇、左炔诺孕酮各自不同晶型拉曼光谱图见图2，拉曼位移值见表1。

2.33种甾体类避孕药物多晶型拉曼光谱鉴别分析 由图2可知，米非司酮、炔雌醇和左炔诺孕酮拉曼光谱图差异明显，每一品种药物多晶型之间拉曼光谱峰强度、峰位置、峰数量及峰展宽等均存在差异。

3种甾体类避孕药物具有相似的甾环主体结构，D环上均具有炔基取代基，因此3种避孕药物拉曼光谱在特定波数区段体现出一定程度相似性，如在2750～3250 cm-1之间CH振动高波数区间，具有连续多重峰；在1500～2500 cm-1之间C≡C伸缩振动区域，通常具有主强峰，上述特征可作为利用拉曼光谱对甾体类避孕药物进行鉴别分析的重要信息。

3种甾体类避孕药物除由于相似化学结构导致部分拉曼光谱特征相似之外，各自还有特异性较强光谱特征，如炔雌醇A环连接一个羟基，局部结构与苯酚相似，故炔雌醇拉曼光谱在3290 cm-1附近弱散射峰可归属为酚羟基伸缩振动；米非司酮E环连接-N(CH3)2基团，故米非司酮拉曼光谱在1382 cm-1处具有独立散射峰，可归属为E环上C-N伸缩振动。3种甾体类避孕药物拉曼光谱主要差异见表2。

由表2可知，拉曼光谱可以作为3种甾体类避孕药物的有效鉴别分析手段。在此基础之上，拉曼光谱亦可对每种甾体类避孕药物多晶型实现较好定性鉴别分析。

A.米非司酮；B.炔雌醇；C.左炔诺孕酮。

A.米非司酮；B.炔雌醇；C.左炔诺孕酮。

2.3.1米非司酮3种晶型的拉曼光谱鉴别分析 米非司酮是孕激素受体拮抗剂，体内可产生抗孕激素作用[15]。米非司酮常见晶型为晶M型、晶N型和晶W型，其中晶M型、晶N型为不含结晶溶剂的晶态物质，晶W型为无定型物。

3种晶型拉曼光谱图主要区别在于：①晶M型在482 cm-1处为单峰，晶N型在此波数附近则裂分为双峰。拉曼光谱低波数振动主要来自于化合物骨架变形振动，差异产生的可能原因在于单键旋转导致苯环及其取代基发生转动进而导致2种晶型分子构象不同。②晶N型在1280和1306 cm-1处为相邻双峰，晶M型在该波数附近则显示为多重峰，2种晶型分子在构象上存在差异，A环平面不能重合，基团所处环境不同，进而振动发生变化[16]。③晶W型为无定型，其峰相对强度更弱，峰展宽相较于2种晶态物质更宽、更钝，图谱荧光干扰背景也更大。晶W型通过球磨制备得到，微观结构中不存在晶格排列，为无定型态，入射激光引起分子振动能力也随之改变。

2.3.2炔雌醇2种晶型的拉曼光谱鉴别分析 炔雌醇是雌激素类衍生物，是常用复方口服避孕药中使用的雌激素种类[17]。炔雌醇可药用晶型有2种，即晶A型与晶B型。其中晶A型为无溶剂晶型，晶B型为炔雌醇半水合物，2种晶型分属于正交晶系与单斜晶系。

2种晶型拉曼光谱图差异较大，主要区别在于：①部分拉曼特征峰相对强度存在差异，晶A型与晶B型均在716 cm-1与2109 cm-1波数附近具有两个吸收强峰。晶A型在717 cm-1处峰强度为152个强度计数、2109 cm-1处峰强度为230个强度计数；晶B型主强峰位于715 cm-1，强度为174个强度计数，次强峰位于2108 cm-1，强度为150个强度计数。据此可以发现2种晶型主强峰与次强峰的相对位置发生变化，强度大小也存在差异。分析原因可能在于2种晶型所属不同晶系，具有不同分子对称规律，进而导致基团振动强度发生变化。②炔雌醇2种晶型在2800～3100 cm-1高波数区间差异明显，该区间内峰相对强度、峰数量以及峰几何拓扑等存在差异。晶A型在2847 cm-1处为单一强峰，晶B型在2846与2860 cm-1处裂分为双峰；晶A型在2861～2918 cm-1之间具有多个尖锐小峰，晶B型在2920与2939 cm-1处具有较强双峰。拉曼光谱高波数区间为CH振动特征区域，引起差异的原因在于晶B型是炔雌醇水合物，水分子作为结晶溶剂介入炔雌醇主体分子空间结构排列，并与炔雌醇分子之间产生氢键作用，引起拉曼振动变化。拉曼光谱变化可以反映水分子作为结晶溶剂对于炔雌醇分子空间排列产生影响，而不是以“隧道溶剂”形式镶嵌于主体分子之间空穴内。

表1 3种甾体类避孕药物拉曼位移值

表2 3种甾体类避孕药物拉曼光谱差异

2.3.2左炔诺孕酮2种晶型的拉曼光谱鉴别分析 左炔诺孕酮是一种强效孕激素，常见晶型有晶α型与晶β型，2种晶型均不含结晶溶剂[18-19]。左炔诺孕酮2种晶型的拉曼光谱图除强度外差异细微，主要体现在以下两个方面：①晶α型在283与310 cm-1处为相邻双峰，晶β型在287 cm-1处为较显著单峰，287 cm-1处拉曼散射峰可归属为乙基取代基骨架变形，乙基支链转动导致基团振动变化。②晶α型在1659 cm-1处散射峰强度为100个强度计数，晶β型在1659 cm-1处散射峰强度为310个强度计数。由于2种晶型构象存在差异，导致碳骨架振动强度发生改变。左炔诺孕酮晶α型与晶β型的拉曼光谱差异细微，故可选择拉曼光谱作为该品种药物多晶型鉴别分析的辅助检测手段。

3 讨论

通过拉曼光谱技术对米非司酮、炔雌醇、左炔诺孕酮的多晶型进行表征，研究发现采用拉曼光谱可以对上述3种药物的多晶型实现定性鉴别分析。

3种甾体类避孕药物由于具有相似甾环主体结构和炔基取代，其拉曼光谱在特定的波段具有相似的散射峰，这些特征光谱信息可用于该类药物的结构鉴别。由于每种药物结构不同，每种药物亦具有特异性的光谱特征，故可以选择拉曼光谱作为甾体类避孕药物的鉴别分析手段。

在此基础上，拉曼光谱获得与甾体类避孕药物多晶型成因相关的结构信息，拉曼光谱可作为甾体类避孕药物多晶型的鉴别分析方法。甾体类避孕药物分子由于排列方式和对称规律不同，会对峰的裂分和峰的位置等特征信息产生影响；物理方式对晶格造成的破坏因素，如晶态和无定型态会对不同晶型的拉曼光谱相对峰强度产生影响；结晶溶剂的介入，反映在拉曼光谱中也可以表现为拉曼散射峰数量、峰位置等光谱信息变化，据此可以判断溶剂分子的结合方式是隧道溶剂还是结晶溶剂。

拉曼光谱用于甾体类避孕药物多晶型鉴别时具有一定局限性，如左炔诺孕酮2种晶型的拉曼光谱差异较细微，这种情况需联合运用PXRD、红外光谱、热分析等技术方法完成多晶型的鉴别确证[20-22]。拉曼光谱技术可对甾体类避孕药物的多晶型开展定性鉴别，对甾体类避孕药物的多晶型进行定量研究，从定量的角度提高其质量控制水平也是需进一步研究的问题。