醋酸甲羟孕酮标准物质的研制与定值研究*

谢逸菲，张丽，张宝喜，杜冠华，吕扬

(北京协和医学院&中国医学科学院药物研究所1.药物晶型研究中心、晶型药物研究北京市重点实验室；2.药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050)

醋酸甲羟孕酮属于人工合成孕激素类药物，大剂量时能够通过抑制卵泡发育和阻止排卵方式减轻子宫内膜异位症所致疼痛，小剂量时能够治疗非典型子宫内膜增生、子宫内膜癌、宫颈癌及肾癌等疾病[1-3]。此外，该药能够通过抑制体内性激素水平和减少性腺激素释放方式达到女性避孕目的，并可用于制作长效避孕针[4]。在医药领域，标准物质是指用于药物含量测定、鉴别以及进行纯度试验的具特性值的物质，在研制过程中通常采用多种方法进行联合定值，方法间能够相互补充，使数据更加科学准确，并通过不间断的溯源链与国际单位进行统一，以确保全球量值的准确和一致[5-9]。

目前，我国避孕节育类药物化学计量标准物质尚存在短缺现象，通过查询国家标准物质信息服务平台数据库，笔者未发现醋酸甲羟孕酮纯度标准物质的相关信息。本研究采用质量平衡法(mass balance，MB)与差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)两种不同原理的方法研制醋酸甲羟孕酮化学计量标准物质，可为药物质控及评价提供可溯源性标准，也是将药物推向国际市场的有力支撑，并且对于我国避孕节育类药物及相关制剂的质量控制具有重要的科学意义[10-12]。

1 仪器与试药

1.1仪器及条件 Mettler Toledo DSC 1型差示扫描量热仪(Mettler Toledo公司，瑞士)，标准40 μL铝(Al)坩埚，以0.5 ℃·min-1速度升温，升温区间为203～210 ℃，氮气(N2)流速50 mL·min-1；Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，DAD检测器，Agilent chemstation工作站，Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流速为1.0 mL·min-1，在波长254 nm条件下，流动相选择水：甲醇=25：75，进样量为5 μL，柱温为30 ℃；Mettler MX5型分析用天平(瑞士Mettler Toledo公司)，感量为1 μg(0≤m≤5100 mg)；AV500-III磁共振波谱仪(Bruker公司，德国)；Mettler Toledo V20型卡尔·费休滴定仪(瑞士Mettler Toledo公司)；SX2.5-10型箱式电阻炉(上海树立仪器仪表有限公司)。

1.2药品与试剂 醋酸甲羟孕酮原料药(武汉远成共创科技有限公司，批号： 20170129，含量：98%)；国家二级锡标准物质：熔点(231.81±0.06) ℃[国家标准物质研究中心，GBW(E)130183]；甲醇(Fisher Chemical公司，美国，色谱纯)；实验用水经Millipore纯水仪纯化制备。

1.3纯度标准物质样品的制备 醋酸甲羟孕酮标准物质候选物由中国医学科学院药物研究所研制。醋酸甲羟孕酮样品经纯化、过筛孔内径(150±6.6) μm(100目)筛，采用2 mL棕色安瓿瓶熔封，每瓶50 mg进行标准物质候选物样品分装，共分装样品600 瓶。

1.4标准物质结构确证 采用质谱、磁共振波谱、红外光谱、熔点分析对样品进行结构确证。①质谱结果： ESI-MS [M+Na]+m/z 409.2， [M+H]+m/z 387.2；②核磁结果：1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz) δppm：5.6(1H，s，4-H)，2.75(1H， m，6-H)，2.05(3H，s，21-COCH3)，1.95(3H，s，23-OCOCH3)，1.18(3H，s，19-CH3)， 1.01(3H，d，J=6.5Hz，24-CH3)，0.95(m，1H，9-H)，0.66(3H，s，18-CH3)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz) δppm：203.4(C-20)，198.10(C-3)，173.61(C-5)， 170.57(C-22)，120.41(C-4)，95.80(C-17)，52.85(C-9)，50.48(C-14)，46.25(C-13)， 39.16(C-7)，38.47(C-10)，35.26(C-1)，34.64(C-8)，33.38(C-2)，32.96(C-6)， 30.43(C-12)，29.67(C-21)，25.97(C-16)，23.31(C-15)，20.89(C-23)，20.30(C-11)， 18.12(C-24)，17.80(C-19)，13.90(C-18)；③红外结果：IR 2947，2911，2869 cm-1处为亚甲基的碳氢伸缩振动峰，1730，1673 cm-1处为内酰胺及酯基的羰基伸缩振动峰，1363 cm-1为甲基酮对称伸缩振动峰；④熔点结果：DSC吸热峰值为207.42 ℃。以上数据与《化学药品对照品图谱集》及《中华人民共和国药典》2015年版(二部)中醋酸甲羟孕酮参考值基本一致[13-14]，综合确定该化合物为醋酸甲羟孕酮，分子式为C24H34O4，结构见图1。

图1 醋酸甲羟孕酮的化学结构

2 方法学考察

本研究联合DSC法与MB法两种不同原理的方法研制醋酸甲羟孕酮标准物质，并进行定值研究。首先通过方法学考察，寻找最优定值条件，通过准确度评估，以减少定值过程中不同方法引入的不确定度。

2.1DSC法 依据范霍夫方程(Van’t Hoff Equation)进行DSC法纯度测定，通过热焓与温度变化过程中的焓变，建立数学模型，计算杂质含量并获得样品纯度。

式中：x为纯物质的摩尔百分比，T0为纯物质熔点值，Tm为物质真实熔点值，R表示气体常数。在恒定的升温速率下，通过测定物质的熔融DSC曲线，获得物质的摩尔熔融焓变，通过拟合计算，最终可以获得被测物的纯度值。

2.1.1升温速率考察 考虑到DSC分析过程中升温速率对化学纯度测定结果准确性的影响，考察升温速率为0.3，0.5，0.7 ℃·min-1时的3种不同升温速率对化学纯度分析结果的影响，经分析，纯度结果分别为：99.51%，99.50%，99.51%，分析结果具有良好的重现性。故选用0.5 ℃·min-1作为DSC定值分析的升温速率。

2.1.2称样量考察 精密称取7份质量为1.25，1.65，2.14，2.54，2.88，3.36，3.98 mg的纯度标准物质候选物样品，吸热峰面积结果依次为108.24，139.57，182.43，218.96，249.85，292.64，353.58 mJ。获得线性回归方程：Y=89.970 5X-8.029 2(X为纯度标准物质样品质量，Y为吸热峰面积)，相关系数R2为0.9991(n=7)，线性关系良好，符合纯度定值方法的要求。

2.1.3精密度考察 精密称取标准物质候选物样品约3 mg，共计6份，获得吸热峰面积值，经结果分析，RSD值为1.65%，小于2.0%，符合方法精密度要求。

2.2MB法 MB法是建立在高效液相色谱面积归一化法的基础上，通过扣除标准物质候选物样品中的杂质含量(包括：水分I水分、炽灼残渣I炽灼残渣、溶剂残留I溶剂残留和有机杂质I有机杂质)获得的物质纯度值，因此标准物质候选物纯度P物质纯度的计算公式为：P物质纯度=(100%-I有机杂质)×(100%-I水分-I炽灼残渣-I溶剂残留)×100%，这种方法能够避免在高效液相色谱中无法检出的水分、无机物、溶剂残留等杂质对纯度的影响。

2.2.1供试品溶液配制 精密称取醋酸甲羟孕酮纯度标准物质候选物样品5 mg，选择甲醇作为溶剂，在50 mL量瓶定容，得到供试品溶液，浓度为100 μg·mL-1。

2.2.2高效液相色谱条件优化 通过对不同型号色谱柱、流动相种类、流动相比例以及检测波长等因素进行考察。最终选用Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，在波长254 nm条件下，流动相选择水：甲醇=25：75进行纯度测定。

2.2.3杂质含量的测定 对MB法中无法直接通过高效液相色谱法获得的杂质含量进行考察。①水分杂质含量：采用卡尔·费休滴定仪测定，样品中水分含量平均值为(0.266 4±0.004 50)%(n=10)；②炽灼残渣含量：测定样品中炽灼残渣含量平均值为(0.031 1±0.017 7)%(n=10)；③溶剂残留含量：采用气相色谱法对制备过程中常用的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯5种溶剂进行检测，经线性回归方程计算溶剂残留总含量为(0.028 0±0.021 0)%(n=10)。

3 均匀性与稳定性考察

根据JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》与JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中的技术要求，分别对标准物质候选物样品的均匀性与短期、长期稳定性进行考察，获得的均匀性结果通过单因素方差分析，稳定性经t检验，最终确定该物质是否符合标准物质的相关要求。

3.1均匀性考察 随机抽取25瓶已封装样品，每瓶取样3份，采用MB法进行均匀性考察。检查结果经单因素方差分析：组间平均方差为9.72×10-9，组内平均方差为7.07×10-9，F=1.38，小于临界值F0.05(24，50)=2.04。结果说明醋酸甲羟孕酮纯度标准物质候选物样品符合样品均匀性要求。

3.2稳定性考察 将封装后的标准物质候选物置于高温(60 ℃)、光照[强度(4500±500) lx]条件下，于0，5，10，15，20 d取样，采用MB法进行稳定性考察。检测结果经t检验，表明标准物质候选物能够满足短期运输的稳定性要求。将标准物质候选物样品置于常温(20 ℃)条件下，于0，1，2，4，6，12个月取样，进行长期稳定性考察。通过线性拟合分析，直线斜率不显著，表明醋酸甲羟孕酮标准物质候选物符合有效期内储存的稳定性要求。

4 DSC法与MB法联合定值及不确定度评定

本研究选取DSC法与MB法联合进行醋酸甲羟孕酮标准物质候选物特性值定值分析，能够避免单一方法的局限性，使候选物样品定值结果的准确性得到提高，两种方法在定值过程中存在多种因素引入的不确定度。

4.1DSC法定值及不确定度影响因素 精密称取10份样品，采用DSC法测定其纯度值(表1)，通过Grubbs检验剔除可疑值，获得DSC法定值结果。

表1 DSC法定值结果

4.2MB法定值及不确定度影响因素分析 精密称取10份醋酸甲羟孕酮纯度标准物质候选物样品，经MB法测定纯度标准值P(MB)，检测结果见表2。

表2 MB法定值结果

DSC法与MB法不确定度影响因素与结果见表3。

4.3MB法与DSC法联合定值 采用MB法与DSC法对醋酸甲羟孕酮纯度标准物质进行联合定值，通过t检验方法对两种不同原理定值的结果进行比较，并对结果的一致性进行考察。经t检验，两种方法获得的数据结果符合一致性要求。因此，醋酸甲羟孕酮纯度标准物质候选物样品的纯度值为两种方法的算术平均值，即99.54%。

表3 DSC法与MB法不确定度影响因素与结果

5 讨论

采用MB法与DSC法2种不同原理的方法对醋酸甲羟孕酮标准物质候选物进行纯度特性值和不确定度值标定。在特性值测定过程中综合考虑对醋酸甲羟孕酮纯度准确性及不确定度产生影响的多种因素，最终醋酸甲羟孕酮标准物质的定值结果为(99.5±0.5)%(k=2，P=0.95)，满足国家一级标准物质要求的均匀性、稳定性、量值溯源性及量值传递性的要求，并已取得国家市场监督管理总局资格认证，国家一级标准物质证书编号为GBW 09592。醋酸甲羟孕酮标准物质的研制填补了我国在避孕节育类药物化学计量标准物质方面的短缺，为该药物的科学储存、运输、质量控制以及计量监控等提供了更有效的物质基础和科学依据。