穴位埋线对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠运动功能的影响

黄琴，周立志，谭彩玲，郑苏，彭力

1.湖北医药学院附属医院（十堰市太和医院）中医康复综合部，湖北十堰市 442000；2.十堰市中医医院，湖北十堰市442000

脑卒中在世界范围内60岁及以上人群中居死因第2 位，15～59 岁人群中居死因第5 位[1]，其高发病率、高死亡率和高致残率给家庭和社会带来沉重的负担。脑卒中的治疗关键在于通过溶栓等手段恢复缺血区域的血流，但实际上只有11%脑卒中患者接受组织型纤溶酶原激活剂溶栓；而在这些患者中，仍有一半患者伴随不同程度的运动功能障碍[2]。日常生活活动能力训练、神经促进技术、运动再学习等康复手段可促进脑卒中后运动功能的恢复，但大多数脑卒中后遗症患者即使经过康复治疗，仍表现出持续性运动功能障碍[3]。寻求对脑卒中后运动障碍新的有效治疗方法是临床上亟待解决的重要难题。

穴位埋线是中医针灸学的延伸和发展，它通过针具和药线在特定穴位产生缓慢而持久的刺激，避免患者每日接受针刺的疼痛，逐渐被应用于临床。穴位埋线可调节神经反射，促进神经功能恢复[4]；抑制炎性因子释放，减少细胞凋亡[5]。本研究观察穴位埋线对缺血再灌注损伤大鼠运动功能障碍的治疗作用，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级雄性Sprague-Dawley 大鼠48 只，3 月龄，体质量250～280 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(鄂)2011-0008。饲养于(23±1) ℃、相对湿度50%、12 h 昼夜交替的SPF 实验环境中，自由饮用食物和水。实验过程中的所有操作均遵循湖北医药学院动物伦理委员会的相关要求。

1.2 模型制作和分组

采用随机数字表法分为假手术组、模型组和穴位埋线组，每组16只。

采用Longa 法[6]制作大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。分离大鼠右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用血管电凝器离断颈外动脉，从颈外动脉残端置入线栓，经颈内动脉入颅后遇阻力即停止，置入线栓长度约19 mm，90 min 后拔出线栓恢复血液灌注。

假手术组仅离断右侧颈外动脉；模型组和穴位埋线组制作MCAO模型；穴位埋线组缺血再灌注90 min后，于百会穴、右侧顶颞前斜线进行埋线。手术过程中室温保持27 ℃，大鼠保持肛温为(37.0±0.5)℃，术后单笼饲养，5%利多卡因涂抹手术切口。

1.3 实验试剂

线栓：广州佳灵生物技术有限公司。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)、蛋白酶抑制剂：美国SIGMA公司。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体、突触素I 抗体：美国ABCAM 公司。酶标山羊抗小鼠(PV-6002)、酶标山羊抗兔(PV-6001)：北京中杉金桥生物技术有限公司。PIPA裂解液、Protein Marker：碧云天生物技术有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyce raldehyde -3-phosphate dehydrogenase,GADPH)抗体：美国CST 公司。Trizol、RNA later：美国ABI AMBION 公司。SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒：日本TAKARA公司。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 神经行为学评分

各组随机选取8 只大鼠，分别在造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d 四个时间点行神经功能评分[7]。于安静环境内由对分组不知情的实验者对大鼠5 min 内自主活动、四肢对称性、前肢对称性、攀笼功能、躯体感觉功能及触须感觉进行评估。满分18 分，评分越低，神经功能损伤越严重。

各组随机选取6 只大鼠，于造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d 四个时间点行改良网屏实验。网屏为50×40 cm 网带，网眼1×1 cm，网屏下方铺12 cm 厚的海绵。将网屏倾斜30°和60°，将大鼠右侧肢体用医用胶带缠缚然后放在网屏上，观察其在60 s 内维持于网屏上或用前爪抓握网屏的时间。大鼠在网屏上维持的时间越短，表明前肢功能损伤越重。

1.4.2 脑梗死灶体积检测

于第14 天神经功能评分结束后，各组随机选取4只大鼠，水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射快速麻醉后断头处死，取完整脑组织置于-20 ℃中保存60 min，去除嗅球和低位脑干后，沿冠状面自额极向后连续、均匀切成7 片，每片厚2 mm。将脑片置入2% TTC 中，37 ℃避光孵育30 min 后显色，4%多聚甲醛后固定6 h，扫描仪获取图像，Image Plus 6.0 软件计算脑组织梗死面积。

校正脑梗死体积百分比=[总梗死体积-(缺血侧脑组织体积-对侧脑组织体积)]/对侧脑组织×100%

1.4.3 HE染色及免疫组化染色

在实验第14 天，每组取4 只大鼠，同法处死，取缺血半暗带脑组织石蜡包埋，切片，片厚3 μm，常规脱蜡、脱水，HE 染色，分别在10、20、40 倍物镜下观察各组脑组织的组织形态学变化。

石蜡切片常规脱蜡至水，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修复10 min；3%H2O2室温孵育10 min；PBS 冲洗3 次，每次5 min，10%山羊血清室温孵育30 min，分别滴加突触素I(1∶200)、GFAP (1∶600)一抗工作液，37 ℃孵育1 h；PBS 冲洗3 次，每次5 min，滴加相应标记二抗工作液，37 ℃孵育10 min；PBS 冲洗3 次，每次5 min；DAB 显色，苏木素复染，PBS 返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜(德国LEICA)观察，Image Pro Plus 6.0 图像分析软件采集大鼠右侧病灶区的免疫信号，计算校正光密度值(corrected optical density,COD)。每张切片选取缺血半暗带区4 个不重叠区域观察，取均值。

1.4.4 Western blotting

每组取4只大鼠，于再灌注14 d后冰上断头取脑，取缺血半暗带区大脑皮质(根据Ashwal等[8]方法确定)。提取总蛋白，加入预冷组织裂解液9 ml/g，组织匀浆后冰上裂解30 min，4 ℃离心20 min 后取上清液。BCA 法蛋白定量，100 ℃加热15 min 变性，总蛋白上清液60 g经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel-electrophoresis,SDS-PAGE)分离，将蛋白质转膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加GFAP 抗体(1∶5000)、突触素I 抗体(1∶5000)、GADPH 多克隆抗体(1∶5000)4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜缓冲液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜3 次，加入相应二抗(1∶5000)室温孵育1 h，ECL 显影。Image J分析目的条带，以目的蛋白灰度值与内参灰度值比值表示其相对表达量。

1.4.5 逆转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)检测

再灌注14 d 后，每组取4 只大鼠水合氯醛麻醉后冰上断头取脑，取缺血半暗带区大脑皮质。按Trizol一步法提取总RNA，反转录成为cDNA，设计GFAP和突触素I特异性引物，以GAPDH为内参对照，根据荧光阈值(cyclethreshold,Ct) 差异，计算目的基因2-△△Ct。

引物序列如下。GFAP 上游：5'-ATC TGG AGA GGA AGG TTG A-3'。GFAP 下游：5'-CGT ACT GAG TGC GAA TCT-3'。突触素I 上游：5'-AGG CTC TGC TAT GCT TGA-3'。突触素I 下游：5'-GCT GCT TGT CTT CAT CCT-3'。GAPDH 上游：5'-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3'。GAPDH 下游：5'-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3'。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以()表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 神经功能评分

各时间点间，假手术组神经功能评分无变化，模型组和穴位埋线组神经功能评分逐渐增加(P< 0.05)。与假手术组比较，模型组各时间点神经功能评分均显著降低(P< 0.001)；与模型组比较，穴位埋线组各时间点神经功能评分均显著增加(P<0.001)。见表1。

2.2 网屏实验

各时间点间比较，假手术组网屏实验时间均无显著性差异(P>0.05)。模型组在术后第1 天较假手术组网屏实验时间显著缩短(P< 0.001)，之后逐渐增加(P<0.01)。穴位埋线组在术后第1 天较模型组网屏实验时间显著增加(P<0.001)，之后逐渐增加(P<0.05)。见表2和表3。

表1 三组神经功能评分比较

表2 三组网屏实验(30°)时间比较(s)

表3 三组网屏实验(60°)时间比较(s)

2.3 脑梗死体积

与模型组比较，穴位埋线组脑梗死体积显著减小(P<0.001)，但未达到正常水平。见图1、表4。

2.4 HE染色

假手术组神经元结构完整对称，排列有序，符合正常细胞形态；模型组半暗带区可见大量神经细胞凋亡和坏死，细胞核皱缩破裂并被深染；穴位埋线组缺血半暗带区域仍有病理变化，但较模型组神经元死亡情况减轻。见图2、图3。

图1 各组TTC染色

图2 梗死中心区和缺血半暗带区脑区定位

图3 三组脑组织HE染色结果

2.5 免疫组化染色

模型组GFAP 阳性表达增加，突触素I 表达降低(P<0.05)；穴位埋线组GFAP阳性表达降低，突触素I表达增加(P<0.05)。见图4、表5。

图4 三组GFAP和突触素I阳性细胞(免疫组化染色，×200)

2.6 Western blotting

与假手术组比较，模型组突触素I 的蛋白水平降低，GFAP的蛋白水平增高(P<0.05)；与模型组比较，穴位埋线组突触素I的蛋白水平升高，GFAP的蛋白水平下降(P<0.05)。见图5、表6。

表4 三组脑梗死体积比较(%)

表5 三组GFAP与突触素I免疫组化阳性细胞比较(COD)

表6 三组GFAP与突触素I蛋白水平比较(/GADPH)

2.7 RT-qPCR

与假手术组比较，模型组突触素I 的mRNA 表达水平降低，GFAP 的mRNA 表达水平下降(P< 0.05)；与模型组比较，穴位埋线组突触素I 的mRNA 表达水平升高，GFAP 的mRNA 表达水平下降(P< 0.05)。见表7。

3 讨论

目前，针对脑卒中后功能障碍，临床主要通过物理治疗、作业治疗、言语治疗等手段进行系统性康复训练。除此之外，计算机[9-11]、人工智能[12-13]、干细胞[14-16]等新型医疗技术也逐渐应用于脑卒中康复。以针刺、推拿为主的传统康复治疗方法，也在脑卒中康复中广泛应用。穴位埋线能在一定程度上改善脑卒中患者的运动功能，提高生活质量[17]。

图5 三组GFAP和突触素I的Western blotting

表7 三组GFAP与突触素I的mRNA水平比较(/GADPH)

脑卒中后运动功能障碍，中医称为“半身不遂”“歪僻不遂”等，认为病位在脑，病机多因气血逆乱、脑脉痹阻、经脉失养所致。百会穴居巅顶，为百脉之会。于百会穴进行埋线，能通达阴阳脉络，连贯周身经穴，调节机体的整体功能。顶颞前斜线位于头顶部侧面，为头部经外奇穴前神聪与颞部胆经悬厘之间的连线，临床多将百会穴与顶颞前斜线连用，用于治疗脑卒中后运动不利。

缺血半暗带是指正常脑血流量区与核心梗死区之间存在的选择性神经元死亡区、蛋白变性区、缺氧区和弥散受限区[18]。及时恢复潜在恢复期的细胞功能可有效改善缺血后的运动功能障碍[19]。缺血半暗带主要分布于大脑皮质，基底节皮质下深部半暗带组织较少[20]。且感觉皮质、运动皮质及辅助运动皮质等区域存在广泛、复杂的结构和功能联系，共同完成精细、复杂随意运动的中枢控制[21]。大脑皮质损伤和相关功能重构被认为是导致多种神经系统疾病或损伤(如脑卒中、脑外伤等)患者运动功能障碍发生和恢复的重要原因之一[22]。

脑损伤后，运动功能障碍恢复的关键在于受损区域的皮质重建和神经细胞修复，这与突触重塑的发生密切相关[23]。突触是神经元细胞间一种特殊的细胞-细胞接触部位，是神经系统参与化学神经传递的主要结构。急性缺血性脑卒中发生后，供应大脑的动脉被阻塞，导致多种病理生理变化，包括血脑屏障破坏、脑水肿、神经元死亡和脑突触损伤等[24]。梗死区域以外的脑区和运动束也可能出现结构异常，并可能诱发功能障碍，导致行为缺陷[25]。

对脑卒中患者进行电刺激，可以改善脑卒中患者的运动功能，包括精细运动功能[26]，缺血半暗带在其中发挥着重要作用。

突触素I 是突触囊泡膜上的特异性蛋白质，参与突触囊泡的导入、转运和神经递质的释放、突触囊泡再循环和突触发生。病理状态下，突触素I 在损伤区域和大脑皮质神经元胞浆、突起及纤维束中的表达明显下降；给予保护性措施后，突触素I 又呈现动态性升高[27]。

缺血再灌注损伤后，星形胶质细胞活化、增生，表现为细胞肥大，GFAP反应性增高[28-29]。反应性星形胶质细胞增生生成的胶质瘢痕抑制神经元轴突的生长，且反应性星形胶质细胞增生后可释放多种细胞因子加重炎症反应，并释放具有神经毒性的谷氨酸盐与活性氧，加重神经元的变性坏死[30]。

本研究显示，穴位埋线后，缺血再灌注损伤大鼠的神经功能和患侧肢体肌力明显提高，缺血半暗带突触素I阳性表达升高，GFAP阳性表达降低，推测穴位埋线可能通过提高缺血半暗带区域的突触传递，加强突触间的联系及传导，进而提高患侧肢体的运动功能。值得注意的是，由于样本量的局限性，缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带脑组织内GFAP 在免疫组织化学、Western blotting 和RT-qPCR 检测中有些许误差，但这种误差并未影响实验结果，在后续实验研究中加大样本量则可减少上述情况。

有研究表明[31-34]，在脑卒中患者生命体征稳定后予穴位埋线治疗，可使脑卒中患者运动功能得到不同程度的改善。也有研究证明[35]，穴位埋线可改善脑缺血再灌注大鼠的肢体痉挛，可能与穴位埋线提高大鼠脑组织中谷氨酰胺合成酶的表达有关。

目前，穴位埋线的临床应用仍更多集中于更年期综合征[36-38]及疼痛相关疾病[39-42]。本研究显示，穴位埋线可用于脑卒中后运动功能障碍的康复。

脑卒中后运动功能障碍的机制复杂，要求我们采用多种方式和手段进行综合康复。穴位埋线的更多作用机制还需要进一步研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。