从AMPK-mTOR信号途径研究淫羊藿总黄酮对衰老大鼠皮层自噬的调节作用

张续蓝，王 婷，郑 杰，望金欣，袁 丁，张长城，周志勇

(1. 三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002；2. 武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430081)

脑衰老使机体对神经退行性疾病易感性增加，是降低高龄人群及其家庭生活质量的主要原因[1]。自噬是一个分解细胞内成分，维持能量平衡，保护细胞免受应激损伤的保守过程。研究表明，自噬与年龄相关的疾病如糖尿病和神经退行性疾病等存在明确的病因学联系[2]。自噬降低导致具有神经毒性的蛋白积聚，从而增加了阿尔茨海默病等老年神经退行性疾病的发病率[3]。因此，增强自噬可能是防治脑衰老的有效措施。

淫羊藿在临床上主要应用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软等的治疗，其主要活性成分之一为淫羊藿总黄酮。现代药理学研究表明，淫羊藿还具有抗衰老、提高学习记忆能力等作用。本课题组前期研究表明，淫羊藿总黄酮(total flavonoids of epimedium，TFE)可以减轻自然衰老大鼠脑组织的炎症反应[4]，并可通过上调自噬改善肠道粘膜屏障功能障碍[5]。但TFE能否调节自然衰老大鼠皮层的自噬尚未见相关报道。因此，本实验探讨TFE对自然衰老大鼠皮层自噬的调节作用及其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物50只SPF级雄性SD大鼠购于北京维通利华实验动物有限公司，饲养于三峡大学实验动物中心SPF级屏障系统中，动物使用许可证编号：SCXK(鄂)2011-0012。

1.2 药物与试剂TFE纯度为80%，购于成都仁诚生物科技公司，溶解于1%羧甲基纤维素钠溶液中备用。总蛋白提取裂解液、BCA工作液均购买于武汉科瑞有限公司。兔单抗β-actin(货号：GB11001)购于中国Servicebio公司。鼠单抗p62(货号：ab56416)、兔单抗Beclin1(货号：ab207612)、兔多抗mTOR(货号：ab2732)均购于英国Abcam公司。鼠单抗LC3B(货号：#83506)、兔单抗p-AMPK(货号：#2535)、兔单抗p-mTOR(货号：#5536)均购于美国CST公司。兔多抗AMPK(货号：sc-25792)购于美国Santa Cruz公司。山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗均购于武汉科瑞有限公司。ECL显影液、尼氏体染色液均购于武汉生物科技公司。

1.3 仪器Power Pas Basic200电泳仪购于美国Bio-Rad公司；Bioshine ChemiQ 4800 mini化学发光凝胶成像显影设备购于上海欧翔科学仪器有限公司；LEICA TP 1020全自动脱水机、LEICA EG 1150H石蜡包埋机和LEICA EG 1150 C超薄切片机均购于德国Leica公司；IX53显微镜购于日本Olympus公司。

2 方法

2.1 动物分组及处理雄性18月龄SPF级大鼠40只，随机等量分为四组，分别为衰老模型组和TFE低、中、高剂量组。灌胃给药，给药周期为4 d，每给药3 d后间隔1 d。按10、20、40 mg·kg-1的剂量分别为TFE低、中、高剂量组给药。衰老模型组给予相应体积的1%羧甲基纤维素钠。同时，设置青年对照组为购买的10只雄性2月龄SPF级大鼠，灌胃给予1%羧甲基纤维素钠。不限制饮食，给药4个月后，每组大鼠中8只留取新鲜脑组织检测相关指标，其余2只留取固定脑组织做病理学方面的检测。

2.2 HE染色大鼠采用腹腔注射20%乌拉坦溶液进行麻醉后，固定于鼠板上开腹腔暴露心脏。将生理盐水通过胸主动脉注入以清洗血液后，持续注入4%多聚甲醛溶液至大鼠僵硬。断头留取脑组织于4%于多聚甲醛中保存固定不超过24 h。梯度脱水、浸蜡包埋、切片后备用。切片脱蜡后于双蒸水中放置2 min，浸入苏木精染液5 min，伊红染液2 min，中性树脂封片，于光学显微镜下观察大鼠皮层神经元形态的变化。

2.3 Nissl染色切片经二甲苯、乙醇处理，脱蜡后于双蒸水中放置5 min，滴加尼氏体染色液，于37 ℃恒温箱中染色10 min，用双蒸水冲洗3～5遍，中性树脂封片，于光学显微镜下观察神经元着色及数目变化。

2.4 Western blot称取约0.02 g新鲜皮层组织，按1 ∶ 20加入总蛋白提取裂解液，匀浆、离心后分装上清液。采用BCA法进行蛋白定量。按4 ∶ 1加入5×loading buffer于95 ℃加热10 min，保存于-40 ℃备用。蛋白样品复温后加至凝胶孔中，经SDS-PAGE凝胶电泳后，根据分子量大小转至对应的PVDF膜上。于5%牛奶中封闭1 h，加入一抗后于摇床上4 ℃恒温孵育一夜，加入二抗后于摇床上室温孵育1 h，浸润ECL显影液后观察蛋白表达变化。

3 结果

3.1 TFE对自然衰老大鼠皮层神经元形态的影响如Fig 1的HE染色结果所示，正常对照组大鼠神经元核膜圆润，衰老模型组大鼠神经元松散排列，变性细胞数目增多，变性的神经元核膜皱缩深染，呈三角形或不规则形状，且周围聚集大量神经胶质细胞。TFE低、中、高各剂量组大鼠神经元形态与衰老模型组大鼠相比有明显改善，变性细胞数目减少，且高剂量效果更明显。

3.2 TFE对自然衰老大鼠皮层神经元数目的影响如Fig 2的Nissl染色结果所示，正常对照组大鼠神经元数目较多且着色深，衰老模型组大鼠神经元数目明显减少且着色变浅。TFE低、中、高各剂量组大鼠神经元数目及着色有明显改善，神经元数目增多，着色变深，且高剂量效果更明显。

3.3 TFE对自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1表达水平的影响如Fig 3所示，与青年组大鼠相比，自然衰老大鼠皮层组织中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表达水平明显下调(P<0.01)，而p62的蛋白表达水平明显上调(P<0.01)，表明衰老大鼠皮层组织中自噬水平明显下降。灌胃给予TFE4个月后，与衰老模型组大鼠相比，TFE可上调衰老大鼠皮层LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达水平(P<0.05)，以高剂量效果更明显；同时下调p62的蛋白表达水平(P<0.01)。

Fig 1 Effectof TFE on neuronal morphology in cerebral cortex of natural aging rats by HE staining(×200)

Fig 2 Effect of TFE on neuronal morphology in cerebral cortex of natural aging rats by Nissl staining(×200)

Fig 3 Effects of TFE on protein levels of LC3, p62 and Beclin1

3.4 TFE对AMPK-mTOR信号途径关键蛋白表达水平的影响如Fig 4 所示，与青年大鼠相比，自然衰老组皮层组织中p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显下降(P<0.01)，而p-mTOR/m-TOR明显上升(P<0.01)。灌胃给予TFE4个月后，与衰老模型组大鼠相比，TFE中、高剂量组能明显上调衰老大鼠皮层p-AMPK/AMPK的蛋白表达水平(P<0.05)，同时，TFE不同剂量组均能下调p-mTOR/m-TOR蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)，但不呈剂量依赖性，这说明TFE对mTOR的磷酸化抑制不仅通过AMPK一条途径。

4 讨论

衰老是生命进程中无法避免的结果，其特征是组织和器官的功能逐渐减弱。大脑皮层是涉及记忆、情感、认知等行为的区域，在衰老和阿尔茨海默病样病理过程中，神经元丢失且凋亡数目增多[6]。本实验结果显示，给予淫羊藿总黄酮干预后，改善了自然衰老大鼠皮层神经元的形态和数目，提示淫羊藿总黄酮对自然衰老大鼠皮层神经元有一定的保护作用。

自噬被认为是一把双刃剑，过度激活或者抑制自噬会破坏大脑中细胞器和蛋白质降解的平衡状态，但是它在清除死亡神经细胞方面发挥着重要的作用[7]。LC3是这一过程中的关键蛋白分子，当LC3Ⅰ脂化或结合到自噬体膜上时转化为LC3Ⅱ[8-9]。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化增多代表自噬形成增加。p62是自噬过程中的选择性底物，在与LC3相互作用的区域将聚合物传递给自噬体降解，自噬降低导致p62积累[10]。Beclin1分子为自噬小体在体内开始形成的这一过程所必需，Beclin1生成减少抑制了自噬小体和溶酶体的融合，从而自噬过程被抑制[11]。Garg等[12]研究发现，二甲双胍可以上调D-半乳糖诱导的快速衰老大鼠模型脑内Beclin1的蛋白表达水平，从而改善快速衰老大鼠的脑老化。同时，我们课题组前期研究表明，在衰老过程中，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表达水平下降，而p62的蛋白表达水平上升[13]。本实验结果进一步显示，给予淫羊藿总黄酮干预，可以下调p62的蛋白表达水平，同时上调自然衰老大鼠皮层中LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达水平，提示淫羊藿总黄酮可以激活自然衰老大鼠皮层组织中的自噬抑制。

Fig 4 Effects of TFE on protein levels of AMPK and mTOR

AMPK-mTOR信号途径是参与调节自噬的主要信号途径之一。AMPK作为一种重要的生理能量传感器，激活后可以诱导自噬。AMPK活化后，通过磷酸化TSC1/2和Raptor,负向调控mTOR[14]。Zhang等[15]研究发现，硒-甲硫氨酸可以通过AMPK-mTOR信号途径激活阿尔茨海默病小鼠大脑中的自噬水平，从而改善小鼠的空间学习和记忆障碍。Xue等[16]研究表明，黄桂固体分散片可以通过激活AMPK-mTOR信号途径促进糖尿病模型C57/BL6小鼠海马细胞自噬，从而抑制其凋亡。本实验结果显示，给予淫羊藿总黄酮干预后，p-AMPK/AMPK的蛋白表达水平升高，同时其下游信号分子p-mTOR/mTOR的蛋白表达水平降低，提示淫羊藿总黄酮可通过AMPK-mTOR信号途径发挥其对自然衰老大鼠自噬的调节作用。

综上所述，淫羊藿总黄酮可以通过激活自然衰老大鼠皮层自噬，改善衰老过程中神经元的病理变化，其机制与AMPK-mTOR信号途径有关。