牛蒡苷元通过OPG/RANKL信号通路介导对去卵巢大鼠骨量流失的保护作用

陈丽英 郭远学 陈洪娇 袁伟 王玉芸

海南医学院第一附属医院，海南 海口 570102

骨质疏松症是一种在绝经后妇女和老年人中常见的代谢性疾病。这种疾病的特点是无症状情况下出现骨量丢失，导致骨折风险明显增加，严重影响患者的生活质量[1-2]。迄今为止，用于预防或治疗骨质疏松症的药物虽然表现出一定临床疗效，但是一些药物严重的不良反应，包括使用雌激素可增加乳腺癌的风险，以及长期使用双膦酸盐药物引起下颌骨坏死和胃肠道反应限制临床疗效提高[3]。因此，骨质疏松症的预防和治疗所需药物亟待开发或者改进。植物雌激素是一类分子结构类似于17-雌二醇的化合物，与雌激素受体结合，发挥部分雌激素作用。由于植物雌激素可以抑制雌激素信号，因此已成为治疗绝经后骨质疏松症的潜在治疗热点[4]。根据化学结构，植物雌激素可分为异黄酮和木质素。牛蒡苷元(Arctigenin，AGN)是一种木质素植物雌激素，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗纤维化[7]和抗肿瘤[8]等功效。鉴于AGN类雌激素特性以及具有抗炎抗氧化作用，我们假设AGN具有抗绝经后骨质疏松症作用。研究旨在探讨AGN对去卵巢大鼠模型抗骨质疏松作用，并揭示其作用的分子机制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和药物治疗

3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠购买于上海实验动物中心，并饲养在12 h光暗循环，温度控制在(22±2) ℃和湿度控制在50%～60%且可以自由接触食物和水的环境中。大鼠适应性饲养7 d后进行背侧双侧去卵巢术(OVX)或假手术(Sham)[9]，并将大鼠在正常条件下饲养。然后将大鼠分成3组，每组10只：Sham组、OVX组、AGN组[OVX大鼠术后第3天开始给予牛蒡苷元40 mg/(kg.d) 治疗，牛蒡苷元购于Sigma-St. Louis, MO, USA]。药物干预治疗12周后，过量麻醉药物处死大鼠，解剖出双侧股骨和收集血液样本用于检测。

1.2 血清骨代谢指标检测

用南京建成生物工程研究所生产的AKP(A059-1)试剂盒测定血清中碱性磷酸酶(AKP，A059-1)。抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP，R052-2)检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D Systems Inc.，美国)。所有检测均按厂家说明书进行。

1.3 Micro-CT检测

使用SCAN-CO Medical micro-CT(SCANCO Medical AG, Zurich, Switzerland)扫描大鼠左侧股骨。使用VG Studio 2.1 V软件(版本2.6)对股骨进行扫描，并对18 μm(像素)管电压为80 kV且电流为60μA的X射线进行成像。在180 °的范围内总共获取了450个投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的锥束重建软件重建图像切片。从生长板末端起近0.3 mm开始，选择2 mm作为目标区域。通过使用CT分析仪软件绘制定制轮廓来提取皮质骨。获得骨密度(BMD)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁骨体积分数(BV/TV)、小梁数(Tb.N)、小梁分离度(Tb.Sp)，来形成Micro-CT的3D渲染图像。3D参数基于对具有渲染表面的行进立方体类型模型的分析。

1.4 股骨三点弯曲实验

对大鼠股骨进行三点弯曲以确定股骨最大负荷和刚度。简短地说，将左侧股骨放在力学测试装置上。将股骨放在支架的中间位置，以10 mm/min的持续测试速度加载直到股骨骨折。记录数据，最后进行分析以获得极限载荷(N)和刚度(N/mm)。

1.5 组织学观察

右股骨在室温下于4%中性福尔马林缓冲液中固定过夜，并在进行组织学分析前用10%EDTA脱钙28 d。脱钙骨的石蜡切片厚度为4 μm。进行Masson染色以检查骨组织结构的变化。

1.6 WB检测

右侧股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解缓冲液从骨组织中提取总蛋白。用BCA蛋白试剂盒定量测定蛋白浓度。将蛋白与加载缓冲液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其变性。用15 %SDS-PAGE分离50 μg总蛋白，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脱脂奶粉在室温下封闭1 h后，将膜分别与一抗：OPG及RANKL在4 ℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物偶联的二抗在室温下孵育1 h。用ECL试剂(美国Thermo Scientific)显影印迹。使用GAPDH进行归一化。用Image J软件测量各蛋白条带的总和密度。

1.7 统计学处理

实验数据表示为均数±标准差。统计分析用SPSS 22.0软件进行。基于方差和t检验比较两个不同组间差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡苷元治疗12周对骨代谢指标的影响

图1显示了AGN治疗对骨转换标志物的影响。与Sham组相比，OVX组AKP和TRACP水平显著升高(P<0.05)。与OVX组相比，AGN组骨代谢指标AKP和TRACP水平显著降低(P<0.05)。

图1 AGN治疗对骨代谢指标的影响注：和Sham组比较，##P<0.05；和OVX组比较，■■P<0.05。Fig.1 Effect of AGN treatment on the bone metabolism indexes

2.2 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三维重建图像如图2 A所示。股骨干骺端的微观参数如图2B～F所示。OVX组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低，而Tb.Sp则明显升高(P<0.05)。AGN组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P<0.05)，而Tb.Sp则明显低于OVX组(P<0.05)。

图2 三组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果注：a Sham组，b OVX组，c AGN组；和Sham组比较，##P<0.05；和OVX组比较，■■P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.3 股骨组织病理学

股骨干骺端骨小梁的Masson染色如图3所示，Sham组显示股骨干骺端骨小梁网状结构正常。OVX组表现为疏松均匀的骨小梁变薄，导致骨小梁间隙变宽。AGN组骨小梁数量和连接增加明显，表现出明显的结构恢复。

图3 三组股骨的组织病理学注：A Sham组，B OVX组，C AGN组；Masson染色(10×)。Fig.3 Histopathology of femurs from the three groups

2.4 股骨的生物力学变化

股骨三点弯曲试验表明，Sham组的极限载荷和刚度均高于OVX组，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，AGN组的极限载荷和刚度均高于Mod组(P<0.05)，见表1。

表1 三点弯曲试验结果Table 1 results of three-point bending

2.5 WB分析

和Sham组比较，OVX组OPG表达水平明显下调，而RANKL表达水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，和OVX组比较，AGN组OPG表达水平明显上调，而RANKL表达水平显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 使用WB检测OPG、RANKL和GAPDH的相对表达注：和Sham组比较，##P<0.05；和OVX组比较，■■P<0.05。Fig.4 Relative expression of OPG and RANKL to GAPDH use Western blotting

3 讨论

本研究使用去卵巢大鼠模型证实了AGN能减少去卵巢大鼠骨量流失，降低骨转换(AKP和TRACP)水平，提高骨密度和骨强度，提示AGN能改善绝经后骨质疏松症。AGN存在于一系列用于治疗类风湿性关节炎、炎症性疾病和感染的药用植物中[5]。体内和体外研究显示AGN能抑制破骨细胞分化，这有利于类风湿性关节炎和骨质疏松症的治疗[10]。有学者进一步研究发现，通过成骨细胞和骨髓细胞的共培养，AGN显著抑制破骨细胞样细胞的形成[11]。本研究证实AGN可减少去卵巢大鼠骨量丢失可能是通过改善骨代谢，从而改善绝经后骨质疏松症。

众所周知，雌激素缺乏是原发性骨质疏松症(绝经后骨质疏松症)的主要危险。双侧去卵巢导致子宫湿重、股骨干重、BMD、骨生物力学强度和骨量显著降低，这些变化是由于雌激素缺乏引起的[12]。在过去的几十年中，去卵巢大鼠被确认为雌激素缺乏诱导的绝经后骨质疏松症的有力动物模型[13]。由于去卵巢大鼠骨骼发育与人类骨骼发育高度相似，因此被广泛使用[14]。总之，使用去卵巢大鼠模型可评估AGN在治疗原发性骨质疏松症中的作用。更重要的是，本研究采用经典的去卵巢模型，可以更全面地验证分子AGN对绝经后骨质疏松症作用和机制。

根据OVX大鼠的骨吸收和骨形成指标改变，本研究表明AGN能显著降低血清AKP和TRACP的作用，表明成骨细胞和破骨细胞活性均被降低。但是，本研究更加关注药物在抑制骨吸收方面的功效。为了观察松质骨的骨表面重塑改变，本研究使用Micro-CT检测了骨组织形态学以解释BMD的变化。BV/TV是评估重要的骨量和骨质疏松严重程度的指标。Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th是评估小梁骨和骨吸收的主要微观结构变化指标。用AGN治疗12周可降低因BV/TV、Tb.Th和Tb.N升高以及Tb.Sp.降低引起的骨质流失。该结果表明AGN通过抑制骨吸收改善了小梁骨的微观结构。与假设一致的是，AGN处理可以显着改善极限载荷和刚度。

OPG/RANKL/RANK系统在调节骨重建中起关键作用[15]。RANK是一种位于破骨细胞表面的受体[16]。RANK的配体是OPG和RANKL，它们主要由成骨细胞和骨髓基质细胞合成和分泌[17]。RANKL激活RANK，促进破骨细胞分化和骨吸收。RANKL的诱饵受体OPG阻断了这种相互作用。药物阻断RANKL是治疗骨质疏松症的有效方法，证实了OPG/RANKL/RANK系统的作用。如果配体与OPG结合，阻断了OPG与RANK的结合，从而减弱了配体对破骨细胞的抑制作用。另一方面，如果配体与RANKL联合抑制RANKL和RANK的结合，从而抑制破骨细胞的分化和增殖，则表现为抑制骨吸收。这项研究的结果表明，AGN上调OPG表达同时下调RANKLE表达，调控OPG/RANKL比率来改善骨形成和骨吸收失衡，最终达到防治绝经后骨质疏松症的疗效。

综上，牛蒡苷元治疗对去卵巢大鼠骨量流失起到保护作用，而这种效果可能通过调控OPG/RANKL信号通路来实现的。