5种药用植物内生真菌的分离纯化及生物活性研究

郭 钦,杨中铎,孙建慧

(兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730050)

内生真菌 (endophvte)是存在于健康植物的茎叶中,形成不明显侵染的一类真菌[1]。它普遍存在于健康植物组织中,与植物互利共生,且能够发挥与宿主植物本身相同或相似的药理活性,而产生这些作用的物质基础是内生菌在生长繁殖过程中所产生的多种多样的次级代谢产物,它们大多数都具有如抑菌、抗虫等多种生物活性,这些在农业和(或)医药业中具有极大的应用潜力与发展前景[2]。由于植物内生真菌比较容易实现大规模的工业化培养,若搞清药用植物内生真菌产生的次级代谢产物与宿主的药用活性成分具有相同或相似作用的机制,这对于药用植物的新的生产途径,工艺研究及药用植物生长环境的保护,将具有十分重要的经济及生态效益[3]。单胺氧化酶(MAO,monoamine oxidase)是一类催化单胺类物质进行氧化脱氨反应的酶。它存在于细胞的线粒体外膜上,在人体内广泛分布[4],尤其是在神经组织中分布过多,会产生过量的胺代谢产物,这些代谢产物被普遍认为可能会引发各类精神疾病。因此,近几年国内外学者们致力于研究和开发各种结构的单胺氧化酶抑制剂,试图寻找到可逆较好、选择性较高的单胺氧化酶抑制剂,用于抑郁症、帕金森症的治疗[5]。乙酰胆碱酯酶(AChEI,acetylcholesterase)抑制剂被广泛用于阿尔茨海默病(AD,alzhei-me’s disease)、运动失调、重症肌无力等多种神经系统疾病的治疗[6]。实验研究旨在从药用植物内生菌这一微生物资源中寻找对MAO与AchE具有良好抑制效果的提取物,为进一步跟踪其中的活性成分奠定基础。

1 实验材料

1.1 药材与材料

5种植物细叶小檗(Berberidispoiretii)、宝盖草(Lamiumamplexicaule)、陇塞忍冬(Loniceratangutica)、甘青大戟(Euphorbiamicractina)、贯叶连翘(Hypericumperforatum)采自甘肃南部,均由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定。Wistar大鼠购自兰州军区兰州总医院。

1.2 培养基

分离纯化培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,potato dextrose agar)固体培养基:200 g土豆、1 L水、20 g葡萄糖、20 g琼脂。

发酵培养基:PDA液体培养基:200 g土豆、1 L水、20 g葡萄糖。

2 实验方法

2.1 待测样品的制备

(1) 内生真菌的分离和纯化 取5种植物的根、茎、叶及果实,用无菌水冲洗干净。表面灭菌后,用解剖刀将药材根茎果实切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块,药材叶片切成0.5 cm×0.5 cm的小片,接入含硫酸链霉素(200 U/mL)的PDA固体培养基上,倒置于恒温培养箱中以28 ℃培养3～7 d。观察切口与培养基接触处,待有新菌长出后挑取菌丝,经划线法纯化后得到表观形态不一的内生真菌。

(2) 次级代谢产物的提取 将菌株活化后接入PDA液体培养基中,28 ℃摇床培养10～14 d,抽滤得菌丝菌液,将菌液用等体积乙酸乙酯萃取2遍;菌丝用甲醇回流2 h,回流2次,分别得菌液与菌丝的提取物。

2.2 单胺氧化酶活性测定

称取待测物1 mg,用50 μL无水乙醇溶解,用pH值7.6磷酸缓冲液配置成1 mg/mL的待测样品备用。单胺氧化酶活性测定方法与文献[7]中一致抑制率计算公式为

抑制率(%)=[(空白组-空白本底)-(样品-样品本底)]/(空白组-空白本底)×100%。

所有样品平行测3次,取平均值。

2.3 乙酰胆碱酯酶活性测定

采用改进的Ellman方法[8]在96孔酶标板上测定样品的乙酰胆碱酯酶抑制活性,计算方法与单胺氧化酶抑制率计算方法一致。

2.4 内生真菌的分子生物学鉴定

研究对活性最好的菌株XYXB-1进行了分子生物学鉴定,该菌株DNA的提取、ITS区段的PCR扩增、PCR产物的纯化和测序工作,均由上海生物工程股份有限公司完成。

3 实验结果

3.1 不同药用植物组织中内生真菌数量

从5种植物的组织中共分离到48株内生真菌,其中分别从细叶小檗、宝盖草、甘青大戟、贯叶连翘、陇塞忍冬的植物组织中分离得到8株、6株、8株、12株、14株内生真菌,说明药用植物组织中存在丰富的内生真菌资源。

3.2 内生真菌提取物对单胺氧化酶的抑制作用

通过酶标法来测定所有内生真菌提取物的单胺氧化酶抑制活性,计算得到的结果为:终质量浓度为167 μg/mL时,抑制率超过60%的粗提物有25个,其中抑制率超过80%的有6个,抑制率最高的为XYXB-1-L(92.38%),对抑制率超过80%的提取物进一步测定它们的IC50值,结果见表1。

表1 内生真菌次级代谢产物粗提物抗单胺氧化酶活性

3.3 内生真菌提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

通过Ellman法测定所有内生真菌提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性,结果显示对乙酰胆碱酯酶的活性抑制率都很低,当提取物的终质量浓度为100 μg/mL时,活性最高为GYLQ-3-L(贯叶连翘中分离的一株内生菌的菌液提取物),抑制率仅为41.19%。

3.4 XYXB-1的分子生物学鉴定

菌株XYXB-1的ITS序列长度为575 bp,与genebank数据库中的KR822138.1 (Alternariasp.XN-3-1)进行比对,ITS序列的最大相似度为99 %;菌落为黑色,致密毯状,基质为灰色,全缘;将形态学特征与分子生物学分析结合,将内生真菌XYXB-1鉴定为链格孢属(Alternariasp.)真菌。

4 讨论

实验所用的植物均为新鲜植物,从根、茎、叶及果实中依次分离得到3、22、15、8株内生真菌,可以发现相对其他部位,植物的茎中含有的内生真菌资源最丰富。对从植物中分离出的48 株真菌发酵得到的96个粗提物进行生物活性研究,发现BGC-2-L和XYXB-1-L对单胺氧化酶活性较高,IC50值分别为72.08 μg/mL和63.55 μg/mL。从结果中可以看出,内生真菌菌液的次级代谢产物的活性普遍较菌丝体要高。

在以往的报道中,人们陆续发现了链格孢属的次级代谢产物具有抗菌[9]、细胞毒性[10]、抗肿瘤和利尿[11]等生物活性,但是链格孢属的次级代谢产物关于单胺氧化酶和乙酰胆碱脂酶的活性研究鲜有报道,此为首次发现链格孢属的次级代谢产物具有抗乙酰胆碱脂酶活性的文献报道。