中药白芨/聚乙烯醇纳米静电纺丝膜的制备和生物相容性评价

谢晓峰，周寒璞，赵聪，梁优，王芳，黄建平，奉典旭

（1.上海中医药大学附属曙光医院 普外科，上海 200021，2.上海中医药大学附属普陀医院 普外科，上海200062）

创面愈合和组织修复一直是外科医师无法回避的问题，在医学发展的过程中得到不断完善和进步。寻求组织相容性好、植入或覆盖创面无不良反应、可治疗或替代机体中缺损组织、促进愈合的创伤修复材料，始终是外科领域研究的焦点之一。中药外用促进创面愈合和组织修复的历史悠久，疗效独特。白芨（Bletilla striata，BS）为兰科植物白芨的干燥块茎，别名良姜、紫兰，最早记载于《神农本草经》，1963年后收载于各版药典，具有补肺、止血、消肿、生肌、敛疮的功效[1]，素有“必涩而收，入肺止血，生肌治疮，外科最善”之称[2]。白芨在临床上能促进伤口愈合，加速组织重建[3-4]。近年，通过现代医学研究进一步确切证实，其有效成分具有提高创面组织中巨噬细胞、促进血管内皮细胞粘附生长的功能，能显著提高细胞的增殖能力[5]，同时还有抑菌止血的功能[6]。静电纺丝（electrostatic spinning）技术是一种用来制备多孔且空间互连的纳米纤维的技术。在纺丝过程中，带电聚合物溶液进行喷射纺丝，在接收器上形成直径为纳米级的超细纤维[7-9]。制得的纳米纤维具有孔隙率高、比表面积大、均一性好、能最大程度仿生天然细胞外基质等特点，被广泛地应用于组织工程、创伤敷料、药物载体等生物制药等领域[10-15]。挖掘传统有效中药作为原料，利用静电纺丝技术制备成纳米纤维，探索新型创伤修复材料，进一步发挥中药促进创面愈合和组织修复的作用，具有重要的意义。

本研究采用静电纺丝法制备白芨/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）复合纳米静电纺丝膜，通过检测其微观形貌、生物活性和生物相容性，探索传统中药白芨在外科生物医用领域新应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

选用高压静电纺丝机（自制无针头，实验室自主设计），BSA124S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），TJ-3A型微量注射泵（保定兰格恒流泵有限公司），G20型离心机（北京白洋医疗器械有限公司），DF-101S恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司），LEICA SP8激光共聚焦显微镜（Leica，德国），CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司），DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），BD LSRFortessa X-20流式细胞仪（美国BD公司），100目细筛白芨粉剂（上海虹桥中药材有限公司），聚乙烯醇（中国Aladdin公司），戊二醛（中国Aladdin公司），37%优级纯盐酸（中国Aladdin公司），甘氨酸和乙醇固化缓冲液（中国Sango生物技术公司），人胚胎肾细胞系HEK293T（江西江蓝纯生物试剂有限公司），DMEM（美国Gibco公司）和10%胎牛血清（美国FBS，HyClone，Logan），Calcein-AM /PI（英国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 制备白芨和聚乙烯醇复合静电纺丝膜：用PVA（15 wt%）溶液为基体，将PVA溶于50 ℃的去离子水中并搅拌2 h。将100目细筛白芨粉剂（5 wt%）在去离子水中稀释，分别以1:2、1:3、1:4、1:5、直至1:10的BS:PVA体积比混合，以溶液纺丝性为判断标准，探究BS:PVA最优的配合比。将配好的不同BS:PVA混合比溶液加入溶液槽中，低速搅拌均匀，然后通过外加电场进行纺丝，以出丝量为判断标准，探究最优的混合比例。然后在50 ℃条件下搅拌60 min，以保证均匀性。

搭建无针静电纺丝体系，旋转圆筒在溶液槽中旋转，由于高分子的比表面张力，圆筒在旋转过程中会在旋转圆筒的表面加载薄层BS/PVA聚合物溶液，纳米纤维以3 r/min的转速旋转，收集距离为20 cm，施加电压为40 kV，环境条件控制在湿度43%和温度25 ℃。

1.2.2 白芨和聚乙烯醇复合静电纺丝膜形貌表征：将样品接种在纳米纤维皿上，在室温下用2.5 wt%戊二醛固定过夜，然后用PBS洗涤，并用梯度等级浓度（50%～100% v/v）的乙醇脱水15 min。用扫描电子显微镜（SEM）对白芨和聚乙烯醇复合静电纺丝膜的形貌、纳米结构进行观察。利用Image J软件对纳米纤维的直径和分布进行分析。

1.2.3 细胞活性荧光染色和计数实验：细胞培养前，静电纺BS/PVA纳米纤维必须交联，因为所制得的纳米纤维可以在水中立即溶解。交联时，将纤维养护在含5 mL 50% GA、5 mL 37% HCl、40 mL乙醇的混合溶液中，室温下浸泡12 h，然后用无菌水冲洗3次。所有BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜在使用前用5%的甘氨酸浸泡过夜解毒。

人胚胎肾细胞系HEK293T置于37 ℃、5% CO2湿化培养箱中。并将其保存在Dulbecco改良DMEM细胞培养液和10%胎牛血清中培养并传代。

用BS/PVA纳米纤维包被盖玻片，放入24孔板中，将人胚胎肾细胞系HEK293T接种于BS/PVA纳米纤维包被盖玻片。用0.1 g/L多聚赖氨酸包被盖玻片做对照组，分别放入24孔板内，密度调整至5×108/L，孵育3 d分别将两组盖玻片取出。用PBS冲洗3次，加入终浓度为4 μmol/L的Calcein-AM和20 μmol/L的PI荧光染液，然后在37 ℃恒温箱中孵育30 min，用PBS冲洗3次，甘油封片后置于Leica SP8显微镜观察图像：绿色为Calcein-AM标记的为具有细胞活性的活细胞，红色为PI标记的为已破膜的死细胞。分别于第1、24、48小时观察计数，随机选取6个视野，计算活细胞数与细胞总数的比值。

1.2.4 流式检测细胞周期实验：人胚胎肾细胞系HEK293T置于37 ℃、5% CO2湿化培养箱中。并将其保存在Dulbecco改良DMEM细胞培养液和10%胎牛血清中培养并传代。

流式细胞术测量了BS/PVA纳米纤维包覆基质和非包覆表面下的细胞周期，通过流式细胞术测量不同基质下的细胞周期。使用BD LSRFortessa X-20流式细胞仪，制备细胞悬液1×107/mL，PBS洗涤3次，弃去固定液。400目的筛网过滤1次，1000 r/min离心2 min，弃去PBS。然后用FITC和PI处理，4 ℃避光30 min。BD LSRFortessa X-20自动荧光系统下进行细胞流式术。

2 结果

2.1 制备白芨和聚乙烯醇复合静电纺丝膜的最佳参数

在本研究中我们采用旋转圆筒无针静电纺丝工艺，并将BS/PVA溶液用于纳米纤维的制备。在此过程中，我们发现，当对机器施加高电压（40 kV）时，圆柱体产生的尖刺和泰勒锥由此形成。然后，细小的聚合物射流从泰勒锥的尖端喷射到纳米纤维基体上。在纺丝10～15 min后，我们可以获得BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜（图1）。最佳参数为：BS/PVA 1:3，转速3 r/min，采集距离20 cm，外加电压为40 kV。环境条件控制在湿度43%和温度25 ℃。

图1 白芨和聚乙烯醇纳米静电纺丝纤维膜

2.2 白芨和聚乙烯醇复合纳米静电纺丝膜形貌表征

我们发现旋转圆筒无针静电纺丝工艺产生均匀的纳米纤维形成纤维膜。用扫描电子显微镜对BS/PVA纳米静电纺丝膜的形貌、纳米结构进行观察，该纳米纤维表面光滑、形貌均一，未见明显串珠结构（图2）。为了确定纳米纤维的直径，我们使用Image J进行测量，发现BS/PVA纳米纤维约为800 nm，它们均匀地分布在一个薄片上，形成一层薄膜。

图2 扫描电镜下白芨和聚乙烯醇复合纳米静电纺丝纤维膜形貌表征

2.3 细胞活性荧光染色和计数实验结果

定性分析HEK293细胞在BS/PVA纳米纤维膜包被盖玻片和对照组盖玻片上的活性和分布。在黑暗条件下，Leica DMi8荧光显微镜观察，绿色为活细胞，红色为死细胞（图3A）。结果发现BS/PVA纳米纤维膜包被盖玻片上HEK293细胞存活率提高至93%，而用对照组HEK293细胞存活率仅提高至90%（图3B）。为了观察更详细的细胞形态，引入了SEM对细胞样品进行成像。在BS/PVA静电纺丝纳米纤维膜上培养的HEK293表现为扁平的细胞形态（图4）。

2.4 流式检测细胞周期实验结果

结果显示BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜基质上HEK293细胞的细胞周期，与无BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜基质HEK293的细胞周期基本相同（图5）。

图3 A：细胞活性荧光染色（×400）；B：细胞活性计数实验结果（细胞存活率=活细胞数/总细胞数）。

图4 HEK293细胞在BS/PVA静电纺丝纳米纤维上的扫描电镜观察（×2500）

图5 流式检测细胞周期实验结果，蓝色为BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜基质上HEK293细胞的细胞周期，橙色为无BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜基质HEK293细胞的细胞周期。

3 讨论

如何加速创面愈合和组织修复一直是外科医师面临的问题，用静电纺丝技术制备的纳米纤维孔隙率高，比表面积大，均一性好，能最大程度仿生天然细胞外基质。药物能以无定型状态存在于纳米纤维中，从而改善了难溶性状况，主动参与伤口愈合过程[16]。静电纺纳米纤维敷料可诱导细胞增殖、迁移，加速创伤修复，抑制疤痕，在该领域中有广阔的应用和发展前景[17]。我们前期工作发现通过静电纺丝技术制备白芨纳米纤维，覆膜于生物补片，用于大鼠腹壁缺损模型修复，结果显示电纺丝纳米白芨覆膜生物补片组的组织重建速度要快于普通生物补片组[18]。作为创面愈合和组织修复的材料，需易于大规模制备，形貌优良稳定，无毒性且生物相容性好。本研究尝试优化工艺参数，将疏水性中药白芨和PVA混合，以大规模制备BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜。通过研究其微观形貌、生物活性和生物相容性，探索白芨在外科生物医用领域新应用的可行性。

静电纺丝技术可分针式和无针式两类，两者设备的设计因不同的实验室、工厂各不相同。在本研究中我们采用旋转圆筒无针静电纺丝工艺，并将BS/PVA溶液用于纳米纤维的制备。PVA是FDA认证的用于药物传递和生物医药应用的高分子材料，具有良好的生物相容性和可行性。研究发现当对机器施加高电压（40 kV）时，圆柱体产生的尖刺和泰勒锥由此形成，细小的聚合物射流从泰勒锥的尖端喷射到纳米纤维基体上，在纺丝10～15 min后，可以获得BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜。最佳参数为：BS:PVA=1:3，转速=3 r/min，采集距离=20 cm，外加电压为40 kV，环境条件控制在湿度43%和温度25 ℃，得到最终直径为800 nm的纤维膜片。由于无针圆筒静电纺丝技术能提供更高的生产率，采用上述优化工艺参数，可以稳定地制备大规模纳米静电纺丝纤维膜。

扫描电子显微镜观察BS/PVA纳米静电纺丝纤维膜，发现无针圆筒静电纺丝产生的BS/PVA纳米静电纺丝纤维，表面光滑、形貌均一，未见明显串珠结构，均匀地分布在一个薄片上，形成薄膜，使用Image J进行测量，发现BS/PVA纳米纤维直径约为800 nm。提示无针圆筒静电纺丝技术不仅能提供更高的生产率，产生的BS/PVA纳米静电纺丝纤维形貌优良稳定。

通过细胞活性荧光染色和计数实验结果显示HEK293细胞生长良好，分布均匀，且经活死细胞检测试剂Calcein-AM和PI荧光染色，发现BS/PVA纳米纤维膜可将细胞存活率提高至93%，而用非BS/PVA纳米纤维膜对照组（多聚赖氨酸）的细胞存活率仅提高至90%，说明BS/PVA纳米纤维膜细胞活力良好、无细胞毒性。为了观察更详细的细胞形态，我们引入了SEM对细胞样品进行成像，在BS/PVA静电纺丝纳米纤维膜上培养的HEK293表现为扁平的细胞形态。我们发现细胞在表面附着良好，且它们是由具有丝状伪足的界面纳米纤维形成的。以上均表明BS/PVA纳米纤维膜有助于HEK293细胞的生长和增殖。这可能是由于BS/PVA纳米纤维膜为HEK293细胞提供了与体内相似的微环境，更有利于HEK293细胞的增殖、粘附和生长，而且白芨本身具备提高细胞的增殖能力的缘故。

此外，为了了解培养的HEK293细胞的细胞周期模式，我们采用流式细胞术测量了BS/PVA纳米静电纺丝包覆基质和非包覆表面下的细胞周期，结果显示纳米纤维基质上的细胞周期与天然组织移植物上的细胞周期基本相同。因此，这些数据表明BS/PVA纳米纤维具有良好的生物相容性。

总之，疏水性中药白芨通过优化工艺参数，和PVA混合，可以大规模制备成纳米静电纺丝膜。该膜可提高附着细胞活性，生物相容性好。此法拓宽了传统中药白芨在外科生物医用领域的应用，其促进创面愈合、组织修复等功能，是今后可以研究的方向。