产低毒性脂多糖大肠杆菌J5基因重组株的构建

2020-10-26 06:54徐悦周明旭朱纯尹文竹马芳鲍熹张金秋卢宇
江苏农业科学 2020年17期
关键词:大肠杆菌佐剂疫苗

徐悦 周明旭 朱纯 尹文竹 马芳 鲍熹 张金秋 卢宇

摘要:细菌脂多糖(LPS)对宿主细胞具有一定的毒性,但经修饰后的單磷酸类脂A(MPLA)却是一种无毒性的高效免疫佐剂。选择天然O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为出发菌株,利用λ-Red同源重组技术导入外源弗朗西斯菌(Francisella novicida)lpxE基因,缺失大肠杆菌lpxM基因。结果显示,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM基因重组株的LPS鲎试剂活性较DH5α和J5原菌显著降低;对4周龄的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物,重组菌和PBS组的小鼠体征及肝脏切片均正常。同时,腹腔注射大肠杆菌J5和DH5α的小鼠被毛凌乱、精神抑郁、肝脏细胞肿大,发生炎性浸润,有明显的毒性反应。以上结果说明,J5重组菌的LPS已经区别于原菌,是低毒性的MPLA产物。上述重组株的成功构建,能为生产廉价的兽用MPLA免疫佐剂奠定工作基础。

关键词:大肠杆菌;MPLA;Red同源重组;佐剂;疫苗;细菌脂多糖

中图分类号:S182   文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2020)17-0054-05

细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)主要由类脂A、核心多糖和O-抗原3部分组成,其中类脂A是LPS的活性中心,其保守的结构可以被宿主细胞表面的Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)识别并引起机体炎症反应,严重时甚至导致机体休克或者死亡,因此LPS又被成为内毒素[1]。单磷酸类脂A(monophosphoryl lipid A,MPLA)是类脂A在酶的催化作用下水解失去1-磷酸(或1-焦糖酸)后所形成的一种类脂A的衍生物,几乎失去了LPS的毒性,但是仍旧能够诱导机体产生各种免疫活性因子,激活吞噬细胞,MPLA具备一定的免疫佐剂和免疫调理的作用[2-3]。

大肠杆菌J5(O111:B4)菌株是美国Pfizer公司推出的用于奶牛乳房炎灭活菌苗的疫苗株[4]。它是1株O-抗原不完全的粗糙型(R)突变菌,其LPS只含有结构较为单一的Kdo2-类脂A和核心多糖结构。因J5株暴露的核心抗原具有良好的保守性和天然免疫原性,它作为抗革兰氏阴性菌感染的疫苗株在奶牛等家畜上被广泛应用[5-7]。考虑到J5株的LPS天然缺失O抗原且结构简单,30多年的疫苗使用情况显示其安全性可靠,因此本研究选择J5株作为出发菌。通过同源重组技术将J5株基因组乳糖操纵子lac的抑制子基因lacI置换为弗朗西斯氏菌属(Francisella)的lpxE基因,达到常量表达的效果,该基因编码的磷酸酶可以选择性地降解存在于类脂A分子C1位上的磷酸基团,使其LPS成为MPLA结构[8]。与此同时,缺失J5株的lpxM基因,使细菌类脂A的分子C3′位无法正常添加十四碳羟基脂肪酸链,从而只存在5条酰基链,进一步降低LPS对TLR4的激活效率,减少MPLA的毒性[9]。对J5株的LPS进行定向重组改造使其成为可以产低毒性MPLA的工程菌,应用于兽用佐剂的生产中。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与试验动物

大肠杆菌J5株(O111:B4)、Red重组系统质粒pKD3和pCP20由扬州大学朱国强教授惠赠;弗朗西斯菌(F.novicida)基因组DNA由中国农业大学苏敬良教授惠赠;(20±2) g的清洁级ICR雌鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2 培养基和主要试剂

胰蛋白酶(tryptone)、酵母提取物(yeast extract),购自Oxoid公司;琼脂(agar),购自南京翼飞雪生物科技有限公司;β-半乳糖苷酶(ONPG)、L-阿拉伯糖、氯霉素(Cm)和氨苄青霉素(Amp),均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 2 000 DNA Marker、Ex Taq(10 U/L)、dNTP,均购自TaKaRa公司;DNA胶回收试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;Trans2K plusⅡ DNA Marker、克隆载体pEASY-T1 Simple和感受态细胞,均购自北京全式金生物技术有限公司;显色基质鲎试剂盒,购于厦门鲎试剂厂。

1.3 低毒性LPS重组株的构建

1.3.1 引物设计 根据GenBank上发布的大肠杆菌(Escherichia coli) lacI基因和F.novicida lpxE基因序列,设计3对引物,P1、P2位于E.coli J5株中的lacI基因ORF的上下游外翼,用于扩增检测lacI基因及其缺失突变株。其后在P1、P2内侧设计1对同源重组引物P3、P6,其5′端序列与lacI两翼序列同源,P2的3′端序列与lpxE基因序列同源,P6的3′端序列与cat基因序列同源。依照重叠延伸PCR(SOE-PCR)要求设计P4、P5,其中P4的5′端序列与cat基因序列同源,3′端序列与lpxE基因序列同源。再根据GenBank上发布的E.coli lpxM基因序列,设计2对引物,P7、P8位于E.coli J5株中的lpxM基因ORF的上下游外翼,用于扩增检测lpxM基因及其缺失突变株。另外,在P7、P8内侧设计1对同源重组引物P9、P10,其5′端序列与lpxM两翼序列同源,3′端序列与cat基因序列同源。引物由北京擎科生物技术有限公司合成,引物序列见表1。

1.3.2 Red重组构建J5ΔlacI::lpxE 为将lpxE基因插入细菌基因组并常量表达,试验选择lac操纵子中抑制子lacI基因作为插入位点,利用Red重组技术用lpxE基因置换lacI基因。

PCR反应1以F.novicida基因组为模板,P3、P4为引物,扩增lpxE基因;反应2以质粒pKD3为模板,P5、P6为引物,扩增cat基因。反应1和反应2按照常规PCR的方法进行操作,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后通过DNA胶回收并送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。SOE-PCR以反应1和反应2的产物为模板,P3和P6为引物,按照文献[10]方法,分2轮PCR扩增lpxE-cat重组片段。最后产物经DNA胶回收后-20 ℃冻存备用。

按照文献[11]中的方法向已经导入pKD46的J5株感受态细胞中電转lpxE-cat重组片段,通过氯霉素抗性平板筛选1次同源重组菌J5ΔlacI::lpxE-cat,并进行PCR鉴定。然后向阳性菌种导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过对Flp位点的识别消除抗性基因,获得二次重组菌J5ΔlacI::lpxE,利用P1、P2引物扩增目的片段,送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.3.3 Red重组构建J5ΔlacI::lpxEΔlpxM 以构建的J5ΔlacI::lpxE重组株为出发菌株,继续构建lpxM缺失株。以pKD3为模板,P9、P10为引物,按照文献[11]方法扩增cat基因,DNA胶回收后-20 ℃冻存备用。重组的具体方法同“1.3.2”节,分别通过一次重组和二次重组构建J5ΔlacI::lpxEΔlpxM重组株,利用P7、P8引物扩增目的片段,送北京擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.4 β-半乳糖苷酶试验检测lac操纵子的表达

β-半乳糖苷酶试验参照文献[12]进行。将J5株和J5△lacI::lpxE重组株分别接种4 mL于装有LB液体培养基的试管,放置在摇床中,37 ℃、180 r/min 培养细菌8 h。收集菌液,10 000 r/min离心10 min,取培养上清备用。按照文献[13]方法,配制0.02 mol/L ONPG底物溶液,过滤除菌,分装成1 mL/管。分别在每管中加入100 μL的培养上清,另设置1管加入PBS作为空白对照,放置在37 ℃水浴锅中共孵育6 h,观察底物溶液颜色变化。

1.5 细菌LPS的提取和纯化

细菌LPS的提取和纯化按照文献[14]进行。挑取J5株及重组株至LB液体培养基中,37 ℃、180 r/min 培养过夜,并转接至500 mL细菌培养液中扩大培养8 h。收菌时检测菌液的吸光度D600 nm。菌液6 000 r/min离心20 min,并以1 ∶ 10比例浓缩。浓缩菌液在-20 ℃下反复冻融3 次;加入溶菌酶(含50 μg/mL),37 ℃水浴60 min。低温条件下超声破碎菌体,之后将菌液移至200 mL玻璃瓶中,在68~70 ℃下预加热,加入新配制的等体积90%苯酚(体积分数),68~70 ℃下反应30 min,期间每 5 min 摇晃振荡样品,使反应充分进行。结束后将混合液转移至离心杯中,并保存于 4 ℃ 过夜。次日 3 000 r/min 离心样品30 min后取上清,在剩余酚相中加入等体积的ddH2O,重复提取1次,合并2次水相,并移至透析袋中。充分透析去除苯酚后,使用聚乙二醇(PEG 8000)浓缩,使体积至原液的1/5~1/6。将透析袋内浓缩液吸出,离心(4 ℃,3 000 r/min,30 min)取上清,即为LPS粗制品。

在LPS粗制品中加入DNase I和Rnase A,37 ℃水浴60 min,然后置于65 ℃下10 min灭活酶。之后5 000 r/min离心10 min,去除沉淀,将上清冻干处理,得到LPS冻干粉。冻干粉称质量,计算得率,并加入灭菌ddH2O复溶,配制成1 mg/mL的LPS纯品。

1.6 鲎试剂检测LPS活性

按照鲎试剂盒说明书的方法配制内毒素标准溶液,按比例稀释1.5倍,获得LPS待测样品,根据说明试验步骤进行显色,使用全波长酶标仪测定545 nm波长处的吸光度,根据读值结果建立内毒素浓度标准曲线,并计算LPS样品的活性。

1.7 动物试验检测LPS毒性

选取20 g ICR雌鼠40只,10只/组进行分组,设置3个试验组和1个对照组。稀释1.5倍,获得J5、J5ΔlacI::lpxEΔlpxM和DH5α的LPS提取物至500 μg/mL,试验组分别腹腔注射不同LPS提取物(剂量5 mg/kg),注射量为200 μL/只,空白对照组注射200 μL PBS。观测攻毒后小鼠的生理精神状态(食欲、饮欲及活动状况等)和病症,并在攻毒2 d后剖杀小鼠,取肝脏制作石蜡切片,观察其组织病理变化从而判定不同LPS提取物的毒性强弱。

2 结果与分析

2.1 J5Δlac I::lpxEΔlpxM重组株的鉴定

将二次重组菌制备基因组模板,以P1和P2为引物进行PCR扩增鉴定,对照野生型扩增片段为 1 200 bp,重组菌扩增片段为888 bp(图1),PCR产物测序结果正确。以P7和P8为引物进行PCR扩增lpxM基因鉴定,对照野生型扩增片段为 1 066 bp,重组菌扩增片段为179 bp(图2),PCR产物测序结果正确,命名重组菌为J5ΔlacI::lpxEΔlpxM。

2.2 β-半乳糖苷酶试验检测lac操纵子的表达

由图3可知,J5野生菌和J5ΔlacI::lpxE培养上清分别加入底物ONPG孵育后,J5野生菌培养液不变色;J5ΔlacI::lpxE培养液显黄色,说明重组株lac操纵子可正常转录表达,lpxE基因置换lacI成功。

2.3 脂多糖产量比较

J5株及重组株的LPS水溶物均为无色透明液,冻干后为白色粉末状。根据LPS冻干产物称质量的结果,计算出得率,见表1。

2.4 内毒素活性检测

鲎试剂中含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原,是一种凝固蛋白原,能准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素[8-9]。根据定量试剂盒标准品形成的标准曲线的计算公式为Y=0.819 0X+0.305 2,r2=0.990 2。推算测得DH5α的LPS活性为2.3×105 EU/mg,J5原菌的LPS活性为1.7×105 EU/mg,改造菌株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS活性为4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS活性较DH5α和J5原菌显著降低,说明重组菌株改造成功。

2.5 LPS毒性試验结果

2.5.1 临床症状 通过对小鼠分别依次腹腔注射野生株J5,突变株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM以及DH5α的LPS,结果发现,大肠杆菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒组,小鼠被毛凌乱、精神抑郁、有明显毒性反应;而PBS组和J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS提取物组的小鼠正常,无任何临床症状。说明经改造的突变株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS毒性明显降低。

2.5.2 组织病理变化 对攻毒小鼠的肝脏组织进行病理切片,由图4可知,DH5α组和J5组的肝脏细胞肿胀,细胞间隙增大,同时出现不同程度的炎性细胞浸润。相对于DH5α组和J5组,J5ΔlacI::lpxEΔlpxM组肝脏细胞与PBS组的肝脏细胞形态一致,没有明显的病理变化,仅发生局部炎性细胞浸润。说明改造后的J5ΔlacI::lpxEΔlpxM突变株的毒性减弱。

3 结论与讨论

细菌LPS会最大程度地激活机体TLR4、Notch[15]通路, 引起细胞毒性反应。已有研究表明,

改变脂肪酸链的数量、长度以及磷酸基团个数均可降低LPS的毒性,使其发挥佐剂作用[16],其中,MPLA作为类脂A的结构变体,是一种免疫效力显著的佐剂物质。其传统的生产方法是收获R型沙门菌突变株R595的LPS,并对其LPS采用酸解、碱解等一系列繁琐的化学手段脱去磷酸基团及酰基链获得。但该类产物的产率较低,MPLA纯度无法保障,存在多种不同的阳离子使其溶解度降低,可能发生沙门菌污染,生产成本极高。

本研究选用O抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株作为出发菌,利用λ-Red同源重组技术,从生物合成学的角度对细菌完成基因改造,使细菌直接合成MPLA。其中非常重要的改造位点是导入可以去除磷酸基团的弗朗西斯菌的lpxE基因并保证常量表达,因此笔者所在课题组选择lac操纵子中常量表达的lacI基因作为重组位点。lacI具备独立的启动子,可在非乳糖培养环境下常量表达,J5野生菌中β-半乳糖苷酶LacZ在抑制子LacI的作用下转录被阻遏;当lacI基因的ORF被完成置换为lpxE的ORF后,细菌常量表达LpxE而非LacI,原阻遏效应结束,LacZ则开始转录表达并催化底物ONPG,显示黄色;同时,常量表达的LpxE也保证了细菌LPS可以被催化转变为MPLA结构。

导致腹泻的野生猪源大肠杆菌LPS的活性可以达到1.21×107 EU/mg,Sigma公司市售的LPS活性约为1×105 EU/mg[17]。而本研究中使用的大肠杆菌J5株由于其自身作为疫苗株的安全性优势,经笔者所在课题组测定LPS活性仅1.7×105 EU/mg,显著低于猪源野生大肠杆菌。但从小鼠的毒性试验结果可以发现,J5株的LPS仍然可以引起小鼠包括被毛凌乱、精神抑郁等临床反应,肝脏组织也存在明显的病变。相对于J5野生株以及DH5α,经改造J5菌株的LPS提取物对小鼠没有造成明显的临床症状,且肝脏组织切片也确定没有明显病变,说明该改造菌株的MPLA毒性显著低于原野生株,该改造菌株更安全。

尽管本研究已经成功构建了J5ΔlacI::lpxEΔlpxM重组菌,但是其产生的MPLA的佐剂效力仍有待进一步通过动物免疫试验验证和评估。而利用基因重组改造菌株生产并提取MPLA的技术思路,可以直接减少原生产的化学工艺流程中酸解和碱解的步骤,提高产品纯度和产率,显著降低生产成本,从而将廉价、高效的MPLA佐剂应用于兽用疫苗。

参考文献:

[1]Wang X Y,Quinn P J. Endotoxins:structure,function and recognition[M]. Berlin:Springer,2010.

[2]Gregg K A,Harberts E,Gardner F M,et al. Rationally designed TLR4 ligands for vaccine adjuvant discovery[J]. Mbio,2017,8(3):e00417-e00492.

[3]Schülke S,Flaczyk A,Vogel L,et al. MPLA shows attenuated pro-inflammatory properties and diminished capacity to activate mast cells in comparison with LPS[J]. Allergy,2015,70(10):1259-1268.

[4]Tomita G M,Todhunter D A,Hogan J S,et al. Immunization of dairy cows with an Escherichia coli J5 lipopolysaccharide vaccine[J]. Journal of Dairy Science,1995,78(10):2178-2185.

[5]Abdulaziz T A. Elsukhon S N. Chickens hyperimmunized with Escherichia coli J5 strain are protected against experimental challenge with Escherichia coli O78 serotype[J]. Veterinary Research Communications,1998,22(1):7.

[6]Aslam M,Whitemore H L,Kakoma I. Effect of E.coli J5 vaccine and intramammary challenge with live Escherichia coli in lactating dairy goats[J]. Small Ruminant Research,1995,17(3):275-281.

[7]王 刚. E.coli J5菌苗对兔实验性感染巴氏杆菌的保护作用[J]. 预防兽医学进展,2000(3):48-49.

[8]李颜颜. 弗朗西斯菌类脂A的结构多样性及其分子机制研究[D]. 无锡:江南大学,2012.

[9]李颜颜,史 锋,李 烨,等. 细菌类脂A结构与功能研究进展[J]. 微生物学报,2008,48(6):844-849.

[10]Horton R M,Cai Z L,Ho S N,et al. Gene splicing by overlap extension:tailor-made genes using the polymerase chain reaction,BioTechniques,1990,8(5):528-535.

[11]郭志燕. FimA介导F18ab+大肠杆菌病原性的研究[D]. 扬州:扬州大学,2014.

[12]胡会杰,周明旭. 猪源产肠毒素大肠杆菌eltA、flhD、fimA、faeG基因启动子的预测,克隆和鉴定[J]. 中国兽医学报,2015,35(10):1640-1645.

[13]Buelow P. The ONPG test in diagnostic bacteriology. Comparison of the ONPG test and the conventional lactose-fermentation test[J]. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica,1964,60(3):387-402.

[14]Li Y,Powell D A,Shaffer S A,et al. LPS remodeling is an evolved survival strategy for bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(22):8716-8721.

[15]朱丽华,熊御云,夏 琳,等. 积雪草酸预处理对脓毒症小鼠急性肾损伤的影响及机制[J]. 山东医药,2017,57(30):10-13.

[16]Kanistanon D,Hajjar A M,Pelletier M R,et al. A francisella mutant in lipid a carbohydrate modification elicits protective immunity[J]. PLoS Pathogens,2008,4(2):e24.

[17]馮 将,王玉坤,魏玉好,等. 猪源大肠杆菌脂多糖的提取、纯化及活性分析[J]. 中国畜牧兽医,2017,44(3):912-919.

猜你喜欢
大肠杆菌佐剂疫苗
DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响
HPV疫苗,打不打,怎么打
我是疫苗,认识一下呗!
我是疫苗,认识一下呗!
我是疫苗,认识一下呗!
克痹宁凝胶对佐剂性关节炎大鼠的缓解作用
基于树枝状分子及功能化金纳米粒子的电化学免疫传感器检测污泥中大肠杆菌
SD大鼠佐剂性关节炎模型的建立与评估
铝佐剂的作用机制研究进展