红富士苹果果面酵母菌的分布及多样性分析

陈汝 冉昆 薛晓敏 王金政

摘要：以红富士苹果为试验材料，在烟台、威海、临沂、泰安等山东苹果主产区采集成熟健康的红富士苹果，采用稀释分离法从苹果样品果面分离纯化得到酵母菌株;依据核糖体26S D1/D2区核苷酸序列的比较结果，并结合形态学特征，得出酵母菌的分类地位，并对红富士果实表面酵母菌的多样性进行系统进化分析。结果表明，红富士果实表面蕴含丰富的酵母菌资源，分离得到163株酵母菌菌株，经鉴定属于13属20种;在分离得到的菌株中，子囊菌占优势，共分离到95株子囊菌酵母，属于6属10种，占酵母总数的58.3%;共分离得到53株担子菌酵母，属于6属9种，占酵母总数的32.5%;其余15株酵母为普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）等，占酵母总数的9.2%。由研究结果得出，红富士果实表面酵母菌的优势属为毕赤酵母属（Pichia）（3种）、假丝酵母属（Candida）（3种）、隐球酵母属（Cryptococcus）（3种），占总酵母种数的45%。

关键词：红富士苹果;酵母菌;多样性;系统进化分析

中图分类号： S182  文獻标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0134-05

苹果（Malus domestica Borkh.）是山东省规模最大、竞争力最强的优势果品产业，其中晚熟苹果品种红富士占山东省栽培苹果品种的70%。在苹果生产过程中，其病虫害防治问题在很大程度上制约着苹果产业的优质、高效及可持续发展[1-2]。苹果在生长期及贮藏期因病原菌侵染而造成果实腐烂，损失巨大。作为控制植物病害首选的化学杀菌剂，存在农药残留、环境污染及病原菌抗药性等弊端[3-4]。酵母菌具有抗逆性强、耐贫瘠、繁殖快、不产生毒素等优点，因而被广泛用于植物病害生物防治研究中，具有巨大的应用前景[5-7]。拮抗酵母菌[8]单独或与水杨酸[9]、甜菜碱[10-11]、几丁质[12]及氯化钙[13]等结合能有效抑制植物病害。

近年来的研究结果表明，果园生态环境中含有丰富的酵母菌资源，酵母菌在系统发育上呈现多样性，直接的分离源包括水果表面、叶面及土壤[14-15]。Teixido等对“金色美味”苹果园的微生物群落进行研究发现，其主要的微生物群为真菌[枝孢属（Cladosporium）、链格孢属（Alternaria）和酵母（yeasts）][16]。鲜食水果表面分布着大量酵母菌群，如假丝酵母属（Candida）、隐球酵母属（Cryptococcus）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、克勒克酵母属（Kloeckera）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、毕赤酵母属（Pichia）、红酵母属（Rhodotorula）、酿酒酵母属（Saccharomyces）及接合酵母属（Zygosaccharomyces）[17-18]。获得高效拮抗酵母菌的首选方法是从与病原菌具有同一生境并且适应能力强、能够有效定殖的酵母菌中进行筛选[19-21]。苹果园这个特定生态环境中富含大量酵母菌种资源[22]，从中挖掘出的酵母新菌种[23]有待进一步开发利用。本研究从山东省苹果主产区采集的健康红富士果实表面分离、鉴定并保藏酵母菌种，分析红富士果实表面酵母菌的多样性，可为苹果生长期及贮藏期病害的生物防治提供菌种资源，对苹果产业的发展具有重要的理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以红富士苹果为试验材料，于2016年10月下旬在山东烟台（栖霞、蓬莱、莱州、招远）、威海（文登、荣成）、临沂（蒙阴、沂水）、泰安（肥城、新泰）等山东苹果主产区随机挑选生长状况及管理水平基本一致并且处于盛果期的红富士苹果园，分别采集成熟健康的红富士苹果，共采集红富士苹果样品50份（每份包含15个苹果，每个苹果单独用保鲜袋密封）。采后的苹果用保鲜盒保存，运输到实验室后立即进行酵母菌的分离。

1.2 酵母菌株的分离与保藏

采用稀释分离法从不同来源的成熟健康的苹果果实表面分离纯化得到酵母菌株[22]。称取1 g苹果果皮放入50 mL三角瓶中，加入10 mL液体富集培养基（含有10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖、200 μg/mL氯霉素），摇匀，于25 ℃、150 r/min培养2 d后，稀释涂酵母膏胨葡萄糖琼脂（YPD）平板（含200 μg/mL氯霉素）。设5个苹果为1次重复，共重复3次。将涂布均匀的YPD平板置于25 ℃培养箱中培养2～3 d，根据菌落形态特点挑取大小、颜色、形态不同的菌落，纯化后转接至斜面。根据Yarrow的方法[24]对菌落质地、颜色、边缘和表面特征等进行形态学的初步归类。将纯化后的酵母菌活化后4 ℃短期保存，或置于20%甘油管中，于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 酵母菌的鉴定

DNA的提取参照Makimura等的方法[25]进行。核糖体26S D1/D2区核苷酸序列扩增[26]的引物序列为NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′;NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。25 μL PCR反应体系：2.50 μL 10×PCR buffer（2.5 mmol/L，含Mg2+），2.00 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.50 μL NL1（10 μmol/L），0.50 μL NL4（10 μmol/L），0.75 μL DNA模板，0.25 μL（5 U/μL）Taq酶，18.50 μL灭菌水。PCR扩增反应在BIO-RAD S1000TM PCR扩增仪上进行。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。将PCR产物进行电泳检测、回收纯化后送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序。

1.4 数据处理

将所测菌株的26S D1/D2区核苷酸序列提交至GenBank核酸序列数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），进行BLAST分析，与相关序列进行同源性比较，选取与试验菌株亲源关系较近的菌株，用Clustal X软件进行多重序列比对[27]，用MEGA 5.1软件中的邻接法（neighbor-joining，简称N-J）构建系统发育树进行系统进化分析，自展检验重复1 000次[28]。用Bio-Dap计算各样点酵母菌的Shannon多样性指数[29]。

2 结果与分析

2.1 红富士苹果果实表面酵母菌类群数量分布

由表1可知，从山东烟台、威海、临沂、泰安等盛果期苹果园采集的成熟红富士苹果表面蕴含丰富的酵母菌资源，共分离得到163株酵母菌菌株。进一步结合表型特征的观察和生理生化特性，在 GenBank 中通过数据比对确定酵母菌株的分类地位。结果表明，分离的酵母菌属于短梗霉属（Aureobasidium）、隐球酵母属、假丝酵母属、Dioszegia、地霉属（Galactomyces）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、梅拉酵母属（Meira）、梅奇酵母属（Metschnikowia）、毕赤酵母属、红酵母属、酿酒酵母属、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）等13属的20种。优势属为毕赤酵母属（3种）、假丝酵母属（3种）、隐球酵母属（3种），其种数共占酵母总种数的45%。

由表1还可以看出，从烟台地区苹果样品表面共分离到63株酵母菌（11属18种），从威海地区苹果样品表面共分离到40株酵母菌（10属15种），从临沂地区苹果样品表面共分离到28株酵母菌（12属14种），从泰安地区苹果样品表面共分离到32株酵母菌（12属14种）。其中，普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）、金黄隐球酵母（Cryptococcus aureus）、橘假丝酵母（Candida quercitrusa）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、克魯维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、黏红酵母（Rhodotorula glutinis）及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等8种的酵母菌在以上4个地区的苹果样品中均有分布。对以上4个地区苹果样品的酵母菌群落多样性进行分析的结果表明，不同地区苹果样品上酵母菌的多样性存在差异，其中烟台地区苹果样品的酵母菌多样性指数最高，为2.76。

2.2 分离酵母菌株的系统进化分析

选择有代表性的酵母菌株，将其基因序列提交GenBank，获得登录号（表1）后进行系统进化分析。

由图1可以看出，从红富士果实表面分离到的酵母菌主要分布于担子菌（Basidiomycetous）、子囊菌（Ascomycetous）及类酵母（Yeast-like）等三大类中。在红富士果实表面分离的酵母菌中，子囊菌酵母占优势，共分离到95株，占总酵母总数的58.3%，属于6属10种，分别为Candida gelsemii、间型假丝酵母（Candida intermedia）、橘假丝酵母、白地霉（Galactomyces geotrichum）、葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）、克鲁维毕赤酵母、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、酿酒酵母;共分离到53株担子菌酵母，占总酵母总数的32.5%，属于6属9种，分别为金黄隐球酵母、浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）、Dioszegia zsoltii、梅拉酵母（Meira argovae）、黏红酵母、锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）、掷孢酵母（Sporobolomyces foliicola）、云南掷孢酵母（S. yunnanensis）;分离到普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）等类酵母15株，占总酵母数的9.2%。

3 讨论与结论

酵母菌在自然界广泛存在，水果表面附着了具有代表性的酵母菌群，其他的分离源包括叶片、根系、土壤及海水[6，30]。红富士果实表面含有大量酵母菌种资源，本研究从山东省苹果主产区盛果期苹果园采集的成熟红富士苹果表面分离得到163株酵母菌株，分别鉴定为短梗霉属、隐球酵母属、假丝酵母属、Dioszegia、地霉属、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、梅拉酵母属、梅奇酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酿酒酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属等13属的20种。其中，掷孢酵母属、红酵母属及隐球酵母属等属的酵母菌同样也能在巴西的苹果上分离到[31]。同样的，假丝酵母属、隐球酵母属、有孢汉逊酵母属、梅奇酵母属、毕赤酵母属、红酵母属等属的酵母菌在葡萄牙南部的鲜切苹果上有大量分布[32]。

由于气候、土壤和管理方式等不同，即使是同一品种上分布的酵母菌群组成也各不相同，优势菌

种的类型也不相同[33-34]，从有机苹果园中分离到的酵母菌数量要高于从传统苹果园中分离到的数量[31]。在同一生境的不同位点，酵母菌群的分布也不完全一致[35]。山东省苹果主产区不同地区红富士果实表面的酵母菌群分布及多样性指数存在差异，仅普鲁兰短梗霉、金黄隐球酵母、橘假丝酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、克鲁维毕赤酵母、黏红酵母及酿酒酵母等8种酵母菌在4个地区的样品中均有分布。其中普鲁兰短梗霉、葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、黏红酵母在意大利北部果园的红富士和金帅果实表面也有分布[15]。不同地区的红富士果园酵母菌种构成存在明显差异，但子囊菌酵母均占较大优势[22]。本研究从红富士果实表面共分离得到6属10种子囊菌酵母95株（占58.3%），共分离到6属9种的担子菌酵母53株（占32.5%），其余为普鲁兰短梗霉等类酵母15株（占9.2%）。由此可见，红富士果实表面酵母菌中同样是子囊菌酵母占优势。

酵母菌的拮抗机制主要有营养与空间竞争、直接寄生作用和诱发寄主抗病性等[6-7]。前人研究表明，卡里比克毕赤酵母、美极梅奇酵母、黏红酵母等能有效抑制苹果果实病害[6，10，36-37]。葡萄汁有孢汉逊酵母广泛用于草莓[38-39]、葡萄[9]、橘子[40]等采后病害的生物防治。普鲁兰短梗霉主要的拮抗机制是产生胞外多糖（EPS）及水解酶等抑制病原菌[41]，还可通过营养和空间竞争有效抑制桃采后褐腐病的发生[42]。本研究同样从苹果果实表面获得了以上有效拮抗植物病源菌的酵母菌种，为后期拮抗酵母菌的筛选提供了大量菌种资源，但酵母菌对苹果病害的生防机制还有待于进一步研究。

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